類球紅細菌降解亞硝酸鹽及其影響因素研究

趙志平，唐闊，吉莉莉，陳林，韓煦，王衛*

(1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.四川輕化工大學 化學工程學院，四川 自貢 643000)

亞硝酸鹽是腌臘肉制品加工中常用的食品添加劑，具有護色、抑菌、抗氧化和改善風味等作用[1-2]。李汴生等研究發現，使用亞硝酸鹽加工后的烤翅色澤呈現明亮的紅色，而未添加亞硝酸鹽的烤翅色澤黯淡，且表面發黃[3]。亞硝酸鹽的添加能顯著改善薩拉米的色澤，但不同添加量對薩拉米的色澤差異影響不大[4]。劉鵬雪等研究發現，亞硝酸鈉可以顯著抑制哈爾濱紅腸中大腸桿菌的生長，有效抑制脂肪氧化，發揮良好的

抗氧化作用[5]。亞硝酸鈉的添加可以增加干腌肉中醛類物質的含量，對干腌肉亞油酸的氧化起到顯著的抑制作用[6]。然而，亞硝酸鹽會與生物胺反應產生具有致癌作用的亞硝胺，影響肉制品的食用安全。

使用微生物發酵劑是降低發酵食品中亞硝酸鹽殘留的有效途徑。Kim等研究發現Pediococcusacidilactici，Pediococcuspentosaceus和Staphylococcuscarnosus能夠顯著降低發酵香腸中亞硝酸鹽的殘留[7]。Chen等研究發現，發酵劑不但能夠快速降低成熟期豬肉香腸亞硝酸鹽的殘留，而且可以抑制腸桿菌的生長，提高了香腸的食用安全性[8]。田甜等研究發現，微生物混合發酵劑Pediococcuspentosaceus，Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Debaryomyceshansenii，Lactobacillussakei可有效降低廣式香腸亞硝酸鹽的殘留[9]。

類球紅細菌富含類胡蘿卜素、輔酶Q10等抗氧化活性物質[10-11]，具有多種代謝模式，易于培養，適應環境脅迫能力強，在食品和醫藥領域具有良好的應用前景。本研究探討了類球紅細菌發酵過程中對亞硝酸鹽的降解作用及其影響因素，為類球紅細菌發酵劑的開發提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2.4.1：本實驗室保存。

1.2 主要儀器

YP302N型電子天平 上海菁海儀器有限公司；PHS-3C-01型pH計 上海三信儀表廠；水浴恒溫振蕩器 金壇市金南儀器制造有限公司；HC-2518臺式高速離心機 湘儀設備有限公司；UV-1801紫外可見分光光度計 北京北分瑞利有限公司；EPED-E2-10TJ超純水機 四川優普超純科技有限公司；756PC型生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DHP-9160B通用型超凈工作臺 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 類球紅細菌的活化與微氧培養

取-80 ℃保藏的菌種，在固體培養基上劃線[12]，于30 ℃避光條件下培養3 d。挑取單菌落接種到40 mL培養基中(50 mL錐形瓶)，30 ℃，150 r/min，避光振蕩培養至OD660為0.5～0.6。

1.3.2 類球紅細菌耐受亞硝酸鹽試驗

1.3.3 亞硝酸鹽殘留分析

采用GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法(鹽酸萘乙二胺法)。

1.3.4 亞硝酸鹽初始濃度對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.5 溫度對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.6 pH對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.7 溶解氧濃度對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

2 結果與分析

2.1 類球紅細菌對亞硝酸鹽的耐受性分析

隨著亞硝酸鈉含量的遞增，類球紅細菌OD660的吸光值也越來越小，生長越來越慢，見圖1。

圖1 類球紅細菌對亞硝酸鈉的耐受性分析(P<0.01)

由圖1可知，添加亞硝酸鈉后，類球紅細菌的生長速度明顯受到抑制(P<0.01)，但亞硝酸鹽的濃度不超過100 mg/kg時類球紅細菌仍能在相同時間內生長至對數生長期，表明類球紅細菌對一定濃度的亞硝酸鈉有較好的耐受性。隨著亞硝酸鈉含量逐漸增加，抑菌能力逐漸增強，類球紅細菌的耐受能力逐漸減弱。類球紅細菌對100 mg/kg的亞硝酸鈉有較好的耐受性，符合食品加工過程中規定的使用量。類球紅細菌全基因組已測序[13]，信息學分析表明類球紅細菌基因組中不含有亞硝酸鹽還原酶基因[14]，說明該菌通過其他途徑降解亞硝酸鹽。

2.2 類球紅細菌降解亞硝酸鹽分析

為探究類球紅細菌對亞硝酸鈉的降解性能，將類球紅細菌在含有100 mg/kg亞硝酸鈉的培養基中微氧培養，測定不同時間點亞硝酸鈉殘留，結果見圖2。

圖2 類球紅細菌降解亞硝酸鈉試驗

由圖2可知，隨著類球紅細菌培養時間的延長，培養液中亞硝酸鈉的殘留量逐漸降低。發酵初期亞硝酸鈉降解速率較慢，發酵12 h時降解率僅為3.38%。隨著發酵時間的延長，亞硝酸鈉降解率逐漸上升。發酵24，36，48，60，72 h后降解率分別達到11.32%、14.19%、17.95%、18.42%、22.98%。發酵72 h時降解亞硝酸鈉的能力最強，說明降解時間影響亞硝酸鈉的降解率，此現象與陳曦等的研究結果類似[15]。發酵期間各微生物對亞硝酸鈉的降解速率逐漸加快，可能是由于菌株生長繁殖變快，菌體密度增加，促進了亞硝酸鈉的降解作用[16]。

2.3 亞硝酸鹽初始濃度對類球紅細菌降解亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，菌株在培養12 h時，不同亞硝酸鈉濃度對其降解率沒有明顯影響。此時，類球紅細菌處于延滯期，菌體密度較低，亞硝酸鈉降解率較低。隨著發酵時間的延長，細菌不斷生長繁殖，亞硝酸鈉降解率也隨之升高。隨著亞硝酸鈉初始含量增高，類球紅細菌對亞硝酸鈉的降解率出現了先升高后下降的總體趨勢。這可能是由于亞硝酸鈉具有一定的抑菌性[17]，隨著濃度的增加，抑制了類球紅細菌的生長繁殖，從而降低了類球紅細菌對亞硝酸鈉的降解。亞硝酸鈉的初始用量分別為50，75，100，125，150 mg/kg時，降解72 h后降解率分別達到了23.21%、26.52%、21.26%、14.50%、15.70%，表明亞硝酸鈉的降解率與亞硝酸鈉的初始濃度有關，此現象與龔鋼明等[18]和朱英蓮等[19]的研究結果相似。

圖3 亞硝酸鹽濃度對類球紅細菌降解亞硝酸鹽的影響Fig.3 The effect of substrate concentration on the degradation of nitrite by Rhodobacter sphaeroides

2.4 溫度對類球紅細菌降解亞硝酸鹽的影響

溫度對類球紅細菌降解亞硝酸鹽有較大的影響，結果見圖4。

圖4 溫度對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

由圖4可知，培養12 h時，不同溫度對亞硝酸鈉的降解率沒有顯著性變化，亞硝酸鈉降解率均較低。隨著時間的延長，亞硝酸鈉的降解率均不斷升高，20，25，30，35 ℃發酵72 h后，降解率分別達到20.20%、31.80%、33.66%、35.98%，表明溫度對類球紅細菌降解亞硝酸鈉有顯著影響，此現象與王爽等[20]和張二康等[21]的結果相似。

2.5 pH對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

pH對類球紅細菌降解亞硝酸鈉有較大的影響，見圖5。

圖5 pH對類球紅細菌細菌降解亞硝酸鹽的影響

由圖5可知，培養12 h時，pH對亞硝酸鈉的降解率沒有顯著的影響。隨著培養時間延長和初始pH增大，亞硝酸鈉降解率呈現先升高后降低的趨勢。在72 h后，初始pH為6.0，6.3，6.6，6.9，7.2時，降解率分別達到了26.62%、27.21%、21.11%、20.40%、18.20%。pH為6.0和6.3時，亞硝酸鈉的降解率較高，說明pH影響類球紅細菌降解亞硝酸鈉，此現象與劉玉廷等[22]和蘇容容等[23]的研究結果相似。

2.6 溶解氧對類球紅細菌降解亞硝酸鈉的影響

由圖6可知，在搖床轉速不變的情況下，通過改變錐形瓶中培養液的體積以改變培養液中的溶解氧。培養12～48 h時，隨著溶解氧的降低，亞硝酸鈉的降解率沒有發生顯著性變化。48 h后隨著時間逐漸增加，亞硝酸鈉降解率均不斷地升高，發酵72 h時裝液量為40%、50%、60%、70%、80%的降解率分別達到了20.89%、23.14%、26.73%、25.43%、34.65%。裝液量范圍在70%～80%，培養72 h，亞硝酸鈉降解率較高，說明溶解氧對細菌降解亞硝酸鈉具有較大的影響，此結果與Kampman等[24]和Sun等[25]的研究結果類似。

圖6 溶解氧對類球紅細菌降解亞硝酸鹽的影響

3 結論

本研究探討了類球紅細菌對亞硝酸鹽的降解作用以及影響因素。類球紅細菌對亞硝酸鹽具有較好的耐受性，在100 mg/kg的亞硝酸鹽脅迫下能夠較好地生長。隨著發酵時間的延長，類球紅細菌降解亞硝酸鹽的效率得以提高。類球紅細菌對亞硝酸鹽的降解受溫度、pH、亞硝酸鹽初始濃度和溶解氧等因素的影響。本研究為類球紅細菌降解亞硝酸鹽提供了一定的理論基礎。