基于HS-SPME-GC-MS探究郫縣豆瓣優勢菌株地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的酯合成途徑及能力

楊林子，盧云浩，何強

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

郫縣豆瓣是中國傳統發酵調味品，迄今已有三百多年歷史，以其醬香濃郁、味辣香醇、紅棕油亮等特點，被譽為“川菜之魂”[1]。郫縣豆瓣在自然條件下，由多種類型的微生物與原料經長達半年的協同發酵而成，其獨特風味的形成主要來源于微生物在相對封閉的混合發酵環境中產生的各種呈香物質[2]。酯類物質是郫縣豆瓣等發酵食品中常見的揮發性風味物質[3]，尤其是乙酯類和乙酸酯類物質，其閾值較低，在低濃度時可以呈現出令人愉悅的香氣，平衡產品整體風味；濃度較高時，則會使食品中缺少果香風味，影響產品質量[4]。發酵食品中的酯類物質主要通過微生物途徑產生，化學合成途徑反應時間長且緩慢[5]，因此，探究微生物的酯合成途徑和能力對于控制發酵食品整體風味具有重要意義。

本研究采用氣相色譜-質譜聯用技術，通過建立化

學反應體系探究郫縣豆瓣中地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的酯合成途徑和能力，以期進一步加深對發酵過程中酯合成機制的認識，為加速和改善郫縣豆瓣酯類風味物質的形成提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

地衣芽孢桿菌(NCBI登記號：MK063711)、埃切假絲酵母(NCBI登記號：MK063704):四川大學食品系實驗室保藏菌株，分離自郫縣豆瓣。

1.2 材料與試劑

營養肉湯、YPD液體培養基：1%酵母膏、2%葡萄糖、2%蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

己酸乙酯、乙酸己酯等標準品：購自Sigma公司；己醇、三乙酸甘油酯及其他化學試劑：均為分析純，購自阿拉丁公司。

1.3 儀器與設備

SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)萃取頭 美國Supelco公司；QP2010 GC-MS 日本島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 胞外提取液的制備

地衣芽孢桿菌接種至營養肉湯，埃切假絲酵母接種至YPD液體培養基，分別于28 ℃和37 ℃恒溫搖床培養至對數生長期末期，取活化2次后的菌液在10000 g、4 ℃的條件下離心10 min，取其上清液作為胞外提取液，保存于-18 ℃備用，采用Bradford法測定其蛋白含量[6]。

1.4.2 建立化學反應體系

酯合成反應體系的建立參照Liu等[7]的方法。各體系包括菌株胞外提取液、磷酸鈉鹽緩沖液以及反應底物，在酯化體系中，反應底物為100 mmol/L己酸(乙酸)和100 mmol/L乙醇(己醇)；醇解體系為100 mmol/L己醇與33 mmol/L三乙酸甘油酯。反應體系pH均調整為5.5，接近郫縣豆瓣發酵pH值。各體系建立后立即靜置于30 ℃恒溫水浴鍋中進行反應，每隔20 min檢測一次。

1.4.3 pH值對菌株酯合成活力的影響

酯合成反應體系的建立參照1.4.2，利用緩沖液調節各體系的pH值分別為4，5，6，在30 ℃條件下靜置反應1 h后檢測其產酯情況。

1.4.4 揮發性風味物質的提取

各體系反應結束后，立即放置于60 ℃水浴鍋中，插入萃取頭，采用頂空固相微萃取的方法吸附30 min后，將萃取頭插入GC-MS進樣口，250 ℃解吸3 min。

1.4.5 GC-MS分析

1.4.5.1 氣相色譜條件

DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；不分流進樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至60 ℃，再以8 ℃/min升至140 ℃，最后以12 ℃/min升至250 ℃保持8 min。

1.4.5.2 質譜條件

電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍30～500 m/z，溶劑延遲時間1 min。

1.4.5.3 揮發性物質的定性

主要采用譜庫檢索和保留指數兩種方法對各體系中酯類和前體物質進行定性。譜庫檢索主要依據所檢測物質的質譜信息與NIST 14譜庫作比較，根據相似度進行取舍，一般大于80%時對該物質予以確認；保留指數鑒定法是以C8～C12的正構烷烴為標準，計算樣品中揮發性物質的保留指數，與其他文獻中相同物質的保留物質進行比較。

1.4.5.4 揮發性物質的定量

采用外標法進行定量(μg/mL)，并定義1個酯合成酶活力單位(1 U)為1 h內體系合成1 nmol對應的酯，酯合成比活力為U/μg蛋白。

1.5 數據處理

所有實驗均設置3個平行，并采用SPSS 25.0對實驗結果進行方差分析和顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 酯化途徑

微生物合成酯類物質的常見途徑主要包括酯化、醇解、酸解和酯交換途徑，酯化途徑是指一種酸和一種醇在酯酶的作用下合成相應酯類的過程，酯酶是能夠催化酯鍵水解和形成的酶的總稱[8]；醇解途徑是指一種醇與甘油酯類物質在酯酶或酰基轉移酶的作用下合成相應酯的過程，?；D移酶可以將甘油酯上的?；苯愚D移給醇，且酯酶在水環境下也可以發揮?；D移酶的作用[9-10]；酸解和酯交換途徑通常用于合成具有營養功能的結構化油脂，與食品風味關系不大，本次實驗中未考察。

在酯化反應體系中，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母能夠合成己酸乙酯和乙酸己酯，且產量隨時間的增加而不斷增長，由圖1可知，實驗菌株可以通過酯化途徑合成酯類物質。隨著反應時間的增加，各體系中的酯合成速率不斷變化，但總體呈減緩趨勢，表明在微生物酯酶的作用下，酯化反應作為可逆反應，逐漸趨向于平衡的狀態。在反應60 min時，埃切假絲酵母合成己酸乙酯和乙酸己酯產量分別為101.546 μg/mL和1.573 μg/mL，均顯著高于地衣芽孢桿菌，表明埃切假絲酵母的酯化能力遠遠高于地衣芽孢桿菌。在整個反應過程中，各菌株合成己酸乙酯的產量始終比乙酸己酯高，說明實驗菌株通過酯化途徑合成乙酯類物質的能力相對較強，這與Lu等[11]在郫縣豆瓣中檢測到大量乙酯類物質的實驗結果一致。

圖1 酯化體系中地衣芽孢桿菌(A)與埃切假絲酵母(B)合成酯類物質的產量Fig.1 The yield of esters synthesized by Bacillus licheniformis (A) and Candida etchellsii (B) in esterification systems

2.2 醇解途徑

由圖2可知，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母均可在醇解體系中合成乙酸己酯，但其合成的途徑存在兩種可能：一是醇解途徑，三乙酸甘油酯上的乙?；谖⑸秕ッ富蝓；D移酶的作用下，被直接轉移至己醇而形成乙酸己酯；二是“兩步”反應，即三乙酸甘油酯上的乙?；淮罅克馍梢宜?，隨后乙酸與己醇反應形成乙酸己酯，這個過程的反應結果與醇解途徑類似，但實為酯化途徑[12]。因此，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母是否可以通過醇解途徑合成乙酸己酯還需要進一步分析。

圖2 醇解體系中地衣芽孢桿菌(A)和埃切假絲酵母(B)合成乙酸己酯和乙酸的含量Fig.2 The content of hexyl acetate and acetic acid synthesized by Bacillus licheniformis (A) and Candida etchellsii (B) in alcoholysis systems

在反應前期(0～20 min)，乙酸己酯和乙酸的含量隨時間的增長不斷增加，其中乙酸己酯的增長速率和含量均高于乙酸，表明在地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的作用下，三乙酸甘油酯上的乙?；诜磻捌诒煌瑫r轉移到己醇和水中，且轉移至己醇合成乙酸己酯的速率大于其水解形成乙酸的速率，即在這個過程中有醇解反應的發生，表明這兩株菌可以通過醇解途徑合成酯類物質。Liu等[13]的研究中有類似的實驗結果，酯合成速率及產量遠高于脂肪酸的釋放，相對于水分子，乙酰基可能更傾向于選擇己醇作為目標底物，但也不能完全排除酯化反應的存在。反應20 min時，圖2中A的乙酸含量達到最大值9.61 μg/mL，隨后乙酸大幅度下降，乙酸己酯含量出現波動且在60 min時達到11.17 μg/mL，這可能是由于在地衣芽孢桿菌還原酶的作用下，乙酸形成的速率遠低于被還原形成乙醇的速率，導致乙醇的大量增長(數據未顯示)，打破了體系的平衡狀態，使乙酸己酯在反應40 min后發生了水解。由圖2中B可知，乙酸己酯在20 min后以較低的速率繼續增長，而乙酸含量下降，表明三乙酸甘油酯水解形成乙酸的速率遠低于參與酯化反應消耗乙酸的速率；在反應40 min后，乙酸己酯發生水解，其含量小幅度下降，最終達到26.52 μg/mL，導致乙酸含量的適度增長，故在該體系的反應中后期有酯化反應的存在。

綜合以上實驗結果，埃切假絲酵母和地衣芽孢桿菌可以通過酯化和醇解兩種途徑合成酯類物質，具有較強的酯合成能力，不僅是郫縣豆瓣中的優勢產酯菌株，還廣泛應用于醬油、白酒等發酵食品中發揮增香作用[14]，相對來說，埃切假絲酵母的酯合成能力遠高于地衣芽孢桿菌。此外，實驗菌株通過酯化途徑合成乙酸己酯的產量遠低于醇解途徑，這可能是由于水分子作為酯化反應的產物，相對于醇解反應來說，酯化反應在水環境中受到了一定程度的抑制，導致其產量相對較低[15]。

2.3 pH對菌株酯合成活力的影響

微生物無論通過酯化或醇解途徑合成酯類物質，都是由相關的酶催化反應的發生，而pH是影響酶活力的重要因素，酯化體系和醇解體系中菌株的酯合成比活力受pH變化的影響情況見圖3和圖4。

圖3 不同pH條件下實驗菌株在酯化體系中合成己酸乙酯(A)和乙酸己酯(B)的含量Fig.3 The content of ethyl hexanoate (A) and hexyl acetate (B) synthesized by experimental strains in esterification systems at different pH values

圖4 不同pH條件下實驗菌株在醇解體系中合成乙酸己酯的含量變化Fig.4 The content of hexyl acetate synthesized by experimental strains in alcoholysis systems at different pH values

在酯化體系中，隨著pH值由4增加到6，埃切假絲酵母合成己酸乙酯和乙酸己酯的酯合成比活力不斷降低，分別由16.956 U/μg蛋白降至2.965 U/μg蛋白、0.707 U/μg蛋白降至0.055 U/μg蛋白；此外，埃切假絲酵母在pH為4時通過酯化途徑合成酯類物質的能力遠高于另外兩個pH值，表明埃切假絲酵母所產出的酯酶更傾向于在酸性環境中進行催化反應的發生。地衣芽孢桿菌合成乙酸己酯的酯合成比活力變化與埃切假絲酵母相反，其呈不斷增加的趨勢，由0.014 U/μg蛋白增至0.016 U/μg蛋白；由圖3 中A可知，地衣芽孢桿菌在pH為4時，無法通過酯化途徑合成己酸乙酯，隨著pH值繼續增長到6，合成己酸乙酯的酯合成比活力不斷增加至0.318 U/μg蛋白。因此，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母均更傾向于通過酯化途徑合成己酸乙酯，其酯合成比活力遠高于乙酸己酯。由圖4可知，在醇解體系中，隨著pH值的增加，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母合成乙酸己酯的酯合成比活力的變化趨勢與酯化體系類似，分別由0.245 U/μg蛋白增至3.210 U/μg蛋白、19.673 U/μg蛋白降至17.020 U/μg蛋白。因此，在pH值為4～6的范圍內，地衣芽孢桿菌更傾向于在偏中性的條件下通過酯化或醇解途徑合成酯類物質，而埃切假絲酵母在偏酸性的環境中酯合成比活力較強；此外，埃切假絲酵母的酯合成比活力在不同pH條件下仍遠高于地衣芽孢桿菌，與2.1、2.2中的結果一致。

3 結論

地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母作為郫縣豆瓣發酵過程中的優勢菌株，可以通過酯化和醇解兩種途徑合成酯類物質，其中酯化途徑合成乙酯類物質的能力相對較強，而乙酸酯類物質傾向于通過醇解途徑合成。在pH為4～6的范圍內，地衣芽孢桿菌酯合成活力隨pH值的增加而增強，而埃切假絲酵母在pH為4時酯合成比活力最強。此外，在不同pH條件下，埃切假絲酵母通過酯化或醇解途徑合成酯類物質的能力總是高于地衣芽孢桿菌。本研究通過探究地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的酯合成途徑及能力，為加速積累和改善發酵過程中的酯類物質和平衡郫縣豆瓣的整體風味提供了理論依據。