外泌體mi RNA在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展

王敏 毛明清 李男 加慧 夏書月

沈陽醫學院附屬中心醫院呼吸內科110024

COPD 是一種具有氣流受限特征的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，其發病與肺部對有害氣體或有害顆粒尤其是吸煙引起的異常炎癥反應有關[1]。據估計，目前全世界有超過3億人受到COPD 的影響，到2020年，全世界有6 800萬人死亡，其中470 萬人死于該病[2]。現今外泌體越來越被認為是細胞間通訊、免疫調節、疾病診斷和預后循環生物學標志物的重要載體[3]。許多研究報道，肺疾病患者的外泌體mi RNA 譜與健康人不同，因此外泌體mi RNA 似乎有潛力成為肺部疾病的非侵入性診斷生物標志物和治療靶點[4-6]。本文將介紹外泌體mi RNA 的概念及基本實驗方法，并總結外泌體mi RNA 在COPD 的發生、發展中的作用。

1 外泌體mi RNA及其提取方法

1.1 外泌體及外泌體mi RNA 細胞可釋放具有膜結構的多種小囊泡到胞外，這些細胞外囊泡有不同的亞群，可根據其生物發生和分泌機制的不同而分為外泌體，微囊泡和凋亡小體，其中外泌體是目前研究最熱的亞群[7]。外泌體是指包含了復雜RNA 和蛋白質的小膜泡 (30～150 n m)，現今其特指直徑在40～100 n m 的盤狀囊泡[8]。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體，其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中[9]。近年來，外泌體及其mi RNA 在腫瘤、心血管、肝、肺、腎、血液系統疾病等領域的診斷、預后和治療方面顯示出良好的研究背景，且外泌體mi RNA 也極有潛力成為人類重大疾病的新型分子標志物和治療靶標[10]。mi RNA 是一類長度約19～24 nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因的3'-UTR區部分或完全互補，剪切靶基因的轉錄產物或者抑制轉錄產物的翻譯，從而起到轉錄后調控靶基因表達的作用[11]。mi RNA 廣泛存在于動物、植物、真菌及病毒的基因中，調控生物體生長發育和疾病發生等過程中相關基因的表達。mi RNA 的異常表達可能會導致生理狀態的異常和疾病的發生，在多種癌癥中，mi RNA 的表達水平會明顯改變，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用[12]。在呼吸系統疾病中，mi RNA 表達譜的臨床研究也有望促進炎癥性呼吸疾病的診療進展。

1.2 外泌體mi RNA 的提取、分離及檢測 同一mi RNA受不同提取方法的影響，在外泌體中檢出水平有所不同，不同方法影響RNA 片段分布和mi RNA 表達，未影響mi RNA 相對表達趨勢。黃依瑤等[13]通過采用超高速離心法+Trizol LS 法、Exo Quick+Sera Mir、TEI+TER 與Exo RNeasy試劑盒提取方法分離3例血清中外泌體總RNA(exo-RNA)，分析RNA 片段分布，檢測mi RNA 表達水平，結果表明Exo RNeasy 試劑盒僅需一步提取血清中exo-RNA，且提取RNA 條帶濃度較高，各mi RNA 表達水平較高，適用于大規模提取血清標本進行后續mi RNA 測序和q PCR 等實驗。人體內的循環mi RNA 之所以可以在外周血中穩定存在而免于血液中核糖核酸酶的降解，是因為mi RNA 被微泡、外泌體等囊泡包裹，或者與蛋白質結合形成復合物，循環mi RNA 常規的提取方法是首先裂解包裹mi RNA 的膜結構，再提取釋放入血清的游離mi RNA，但mi RNA 釋放入血液必定遭受各種干擾因素的降解，性質極不穩定，影響提取效率。針對以上問題，有研究提出首先從血清中分離出外泌體，使mi RNA 在被提取之前就已經隨外泌體脫離血清了，從而大大增加了提取效率[14]。目前檢測外泌體內mi RNA 的表達量的常用方法有Northern Blot標準檢測方法、實時定量PCR 檢測、微陣列芯片檢測和大規模測序。目前許多mi RNA 生物傳感方法需要繁瑣的樣本處理過程，包括提取總RNA，在很大程度上限制了它們在生物醫學和臨床研究中的應用。Ra mshani等[15]提出了一種簡單、快速、無PCR 的集成微流體平臺，該平臺集成表面聲波裂解微流控芯片、濃度傳感微流控芯片和給予非平衡離子電流的動膜傳感器，能夠對血漿中自由漂浮的mi RNAs和外泌體包含的mi RNAs進行絕對定量 (＜10%的不確定性)，具有1 p m 的檢測敏感度，與傳統的RT-q PCR 方法不同，該技術不需要外泌體的提取、RNA純化、逆轉錄或擴增。該平臺實驗時間只有30 min，樣本量只需20 ml，大大減少了傳統RT-q PCR 技術的耗時耗量。同樣，Cao等[16]研究團隊開發了一個集成的微流控指數滾動循環放大平臺，用于直接在微加工樣品中檢測mi RNAs的敏感度和特異度，此方法的高敏感度立即解決了樣本消耗方面的挑戰。因此微流控芯片技術將為促進mi RNA分析在生物學和臨床中的應用提供一個有用的平臺。

2 mi RNA與COPD

2.1 mi RNA 與吸煙高危因素 COPD 的發病機制主要是慢性炎癥反應、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化抗氧化失衡及氣道重塑，吸煙是導致這種異常炎癥反應的最主要的因素。越來越多的研究報道，煙草刺激和COPD 發病相關的mi RNA 的差異表達有關。Héliot等[17]研究發現香煙煙霧提取物 (cigarette s moke extract，CSE)等刺激不僅可以影響細胞外囊泡的水平，還可以改變細胞外囊泡中特異性mi RNA 的表達。吸煙改變了人支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中存在的細胞外囊泡的mi RNA 譜，從而影響周圍正常支氣管上皮細胞的狀態。通過對10名吸煙者和10名非吸煙者進行了BALF 中細胞外囊泡的分離，比較2 組細胞外囊泡中存在的10 種mi RNA 的數量，對其進行了統計分析，討論了吸煙狀態的生物學意義，并評估BALF來源的細胞外囊泡中的mi RNA作為煙草暴露潛在生物標志物的價值。研究表明，肺細胞外囊泡的組成和作用實際上取決于吸煙狀況，并且與煙草暴露對肺細胞的早期有害作用有關。

盡管研究表明，吸煙影響肺中mi RNA 的表達，并在COPD 的發展中發揮重要作用，但其確切的影響機制仍需進一步研究。在一項研究中，與沒有氣流受限的吸煙者相比，COPD 患者的外周血單個核細胞有8 種mi RNAs(mi R-24-3p、mi R-93-5p、mi R-320a、mi R-320b、mi R-191-5p、let-7b-5p、mi R-342-3p 和 mi R-92a-3p)上 調 以 及3 種mi RNAs (mi R-3613-3p、mi R-1273g-3p 和 mi R-4668-5p)下調[18]。mi R-24-3p在單核細胞中持續高表達，在吸煙者中，mi R-93-5p主要在單核細胞中表達，而在COPD 患者中，mi R-93-5p在CD4+T 細胞、CD8+T 細胞和單核細胞中均表達。此外，他們還顯示，在COPD 患者中，CD8+T細胞是mi R-320a 和mi R-320b 表達增加的主要細胞類型[18]。在非吸煙者與吸煙者的比較中，一些差異表達的mi RNA 可能是由于吸煙者血液中存在不同的細胞類型 (T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞)，這些細胞釋放的細胞外囊泡/外泌體富含本研究發現的特定mi RNA。

Sundar等[19]驗證了一些源自CSE 處理的人單核細胞(U937)的外泌體mi RNA，顯示大多數mi RNA 表達降低的 趨 勢 (mi R-let-7a-5p、mi R-let7i-5p、mi R-103a-3p 和mi R-151b)。他們發現，與對照組比較，CSE 處理的人類單核細胞 (傾向于下調)和上皮細胞 (傾向于上調)中，外泌體mi RNA 表達的方向性有很大差異。這表明在體外CSE誘導的細胞應激過程中，外泌體mi RNA 的表達差異依賴的是不同的細胞類型。

Serban等[20]發現香煙煙霧暴露能夠提高人和小鼠血漿中的外泌體水平，以及原代人肺微血管內皮細胞上清液中的外泌體水平，香煙煙霧暴露也改變了內皮細胞外泌體的組成，增加了let-7d、mi R-191、mi R-126和mi R-125a的表達，內皮細胞外泌體將這些mi RNA 傳遞給特化的巨噬細胞會影響凋亡細胞的清除。有研究認為香煙煙霧誘導外泌體中的mi RNA 是具有選擇性的，而不是非特異性的反應細胞內的mi RNA 的表達，并且這些靶向效應可能在吸煙者內皮損傷和炎癥相關疾病的發病機制中起重要作用，如COPD。以上探討的外泌體mi RNA 在吸煙所致COPD 中差異表達的原因和作用，對于深入了解吸煙所致肺部疾病及COPD的分子機制，尋找吸煙所致機體損害的早期生物標志物和防治措施提供了有力的證據。

2.2 外泌體mi RNA 與COPD 發病機制 COPD 是一種慢性異質性疾病，其特征是持續和過度炎癥、氣道重塑、氣流受限和肺功能加速下降。外泌體通過旁分泌方式作用于支氣管上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞等鄰近細胞，導致黏液高分泌，成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，巨噬細胞活化等，最終發生氣道重塑與肺氣腫[21-23]。Fujita等[24]研究，在CSE 作用下，原代人支氣管上皮細胞 (hu man bronchial epithelial cells，HBECs)衍生的細胞外囊泡可誘導原代成纖維細胞分化成肌成纖維細胞。經驗證得到，吸煙導致的HBECs細胞外囊泡中的mi R-210表達上調是導致肺成纖維細胞中這種表型改變的原因，并且在肺成纖維細胞中，mi R-210通過下調ATG7負調控自噬過程來參與mi R-210介導的成纖維細胞分化。同時Fujita等[25]研究得出，在肺成纖維細胞中，LC3和ATG5基因敲除的自噬抑制能夠誘導α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原表達水平增加，并增強肌成纖維細胞的分化。高璇等[26]認為，自噬是一個動態的生物過程，在過程中某些產物的增多并不夠證明整個自噬過程是高水平進行的，在COPD 患者及模型中觀察到的自噬標記物的過表達正是自噬這一動態過程在某一節點被阻斷，從而造成自噬中間產物堆積的表現，而延緩COPD 的進展需將被阻斷的自噬過程繼續進行，以清除侵入肺細胞的病原體、代謝廢物等，維持細胞內穩態。Li等[27]研究得出，外泌體mi R-21 在CSE 處理的HBECs中也可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，其作用機制是通過促進低氧誘導因子1α 的表達而下調Von Hippel-Lindau蛋白，從而增加了膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的水平。這些機制結合肌成纖維細胞分化在氣道重塑中的作用可能為COPD 的診斷和治療提供新的線索。

Wang等[28]研究指出，mi R-34可能抑制CD80和CD86的表達和干擾素α的分泌，進而導致COPD 患者中的樹突狀細胞功能障礙，同時mi R-34c也被報道通過調節其靶基因HNF4和SERPINE1，與COPD 患者的肺氣腫嚴重程度密切相關[29]。Gupta等[30]研究表明氣道支氣管上皮細胞之間的外泌體mi R-34a/b/c參與調節氣道炎癥和纖維化過程。Ser ban等[20]提及香煙煙霧暴露使COPD 患者內皮細胞外泌體來源的mi R-125a上調，但未闡明具體機制。王銳英[31]通過高通量測序發現mi R-125a-5p在COPD 中表達水平增高，mi R-125a-5p的升高促進了COPD 中的巨噬細胞向M2型轉變，抗炎作用增加，分泌的促炎因子包括mi R-125a-5p的靶基因IL-16表達下調，從而推測mi R-125a-5p在COPD中可能發揮抗炎作用，是COPD 的保護因子，為COPD 提供新的治療靶點。此類報道證明了外泌體mi RNAs調節炎癥過程影響COPD 病程，反映了mi RNAs、炎癥調節及COPD 間的密切聯系。

2.3 外泌體mi RNA 與COPD 急性加重 急性加重是COPD 癥狀加重的發作，常與呼吸道感染同時發生。此外，病情加重會增加患者病情惡化的傾向，病情加重可能需要住院治療，這會增加COPD 的病死率，這種有害疾病的發展要求尋找能夠識別慢性阻塞性肺疾病急性加重 (acute exacerbation of chronic obstructive pul monary disease，AECOPD)的生物標志物[32]。

Xie等[33]通過對41 名健康對照者，40 名無癥狀重度吸煙者和49 例COPD 患者的血清mi RNA 進行分析后得出，無癥狀重度吸煙者和COPD 患者的血清mi R-21 和mi R-181a水平明顯高于健康對照組。他們認為，血清mi R-21和mi R-181a 水平及其比值對預測重度無癥狀期COPD 的發展具有潛在的生物標志物應用價值。Xu等[34]證實，mi R-21在吸煙者和吸煙的COPD 患者外泌體中過表達，且 mi R-21 水平與第1 秒用力呼氣容積 (forced expiratory volu me at the first second，FEV1)/FVC呈正相關。由于血漿中mi RNA 的差異變化，測量外泌體mi RNA并不等同于測量mi RNA[35]。以上數據表明，血清和血清外泌體的mi R-21水平相似，經Xu等[34]驗證得出，血清外泌體mi R-21 與FEV1/FVC 之間的決定系數高于血清mi R-21與FEV1/FVC 之間的決定系數，提示血清外泌體mi R-21與FEV1/FVC之間存在可靠的相關性，有可能成為預測COPD 嚴重程度的生物標志物。

Wang等[36]研究表明，長鏈非編碼RNA PVT1通過與mi R-146a的相互作用，協助COPD 的疾病管理和急性加重風險預測。經驗證得到，mi R-146在AECOPD 患者中的表達最低，其次是穩定的COPD 患者和健康對照者，它的預測使COPD 易感性降低，急性加重風險降低，同時，mi R-146a與AECOPD 患者和穩定期COPD 患者的慢性阻塞性肺疾病全球倡議分期和炎癥細胞因子水平呈負相關。Sato等[37]進一步研究得出，COPD 患者的肺纖維細胞中mi R-146a的表達水平降低，通過促進靶基因COX-2 表達導致前列腺素2水平升高。前列腺素2是擴大化和自我循環誘導衰老以及COPD 成纖維細胞炎癥的一個關鍵成分[38]。Alexander等[39]發現，來自樹突狀細胞的外泌體含有mi R-146a，它可以在體內免疫細胞之間轉移，他們還證明，含有mi R-146a的外泌體降低了炎癥基因的表達，參與了急性肺損傷的發病機制。外泌體來源的mi R-146a是否參與COPD 的發病機制及分級有待進一步研究，雖然目前沒有報道證實其他的外泌體mi RNA 與COPD 的嚴重程度有關，但外泌體mi RNA 在炎癥調節及COPD 發病機制中的作用越來越被重視。

2.4 外泌體mi RNA 與骨骼肌萎縮 COPD 不僅是一種局限于呼吸道和肺部的疾病，還是一種可以累及肺外各器官的全身疾病，特別是骨骼肌萎縮和功能障礙，是導致COPD 患者生活質量下降和病死率增加的主要危險因素[40]。近年來許多研究發現，在運動受限的COPD 患者中，約40%的患者肺功能并沒有嚴重受損，而表現為明顯的骨骼肌萎縮或功能障礙[18]。COPD 患者在疾病進展中常伴有不明原因的體質量下降，導致其運動受限，特別是中重度患者普遍存在不同程度的外周骨骼肌萎縮，表現為肌力、耐力的下降及易疲勞。目前有研究認為，骨骼肌萎縮的機制可能與全身炎癥反應及內分泌紊亂、缺氧和高碳酸血癥、氧化應激、營養不良、廢用性萎縮、使用類固醇藥物等相關[41]。目前一致認為COPD 是一種全身多系統的炎性反應性疾病，COPD 患者骨骼肌萎縮的發生是由多因素誘導、多種分子生物學機制參與的復雜過程，各種細胞因子及蛋白通路并非單獨起作用，可能在骨骼肌萎縮的機制中相互作用。目前骨骼肌萎縮的具體機制尚不明確，因此發現骨骼肌萎縮的非侵入性標志物，可能為COPD 防治提供新的策略。

Donaldson 等[42]證實COPD 患者血漿中特異性micro RNA 表達減少與骨骼肌無力和肌纖維組成改變有關，具體來說，mi R-1與無脂肪質量呈負相關，而mi R-499 水平與力量和股四頭肌Ⅰ型纖維比例直接相關。不局限于肌肉起源的mi R-16和mi R-122在患者和對照組之間差異無統計學意義。在早期COPD 患者中，血漿mi R-499與肌肉核因子κB p50相關，但與p65無關，而在較晚期COPD 患者中，血漿炎性細胞因子與mi R-206 相關。因此，COPD 患者血漿中肌肉特異性mi RNA 有可能成為骨骼肌萎縮活檢表型的候選生物標志物。Bur ke等[43]研究了在輕度至中度COPD 患者與健康對照組中BALF和血清中外泌體mi RNA的表達差異，目的是研究這些已鑒定的mi RNA 對骨骼肌的影響，結果顯示COPD 血清中發現1 個顯著上調的mi RNA，在COPD BALF中發現4個顯著下調的mi RNA，并且他們利用in-silico分析，研究了這些失調的mi RNA 對基因表達的影響。這一發現涉及哺乳動物雷帕霉素復合物1信號通路的靶基因，包括基因S6 K，骨骼肌消耗的關鍵調節因子。證實了外泌體mi RNA 的新作用，它可能驅動COPD 患者的骨骼肌萎縮的發生。

3 總結與展望

本文總結了近年來關于外泌體mi RNA 的提取、分離和檢測方法，以及外泌體mi RNA 在COPD 發病進程中的作用，探索其作為生物標志物的潛力，以了解COPD 發病機制。特別是含有特定分子特征的外泌體，包括mi RNA，可能被臨床用作診斷和治療COPD 的新生標志物。但其廣泛應用于臨床方面，仍面臨許多困難，還需要對外泌體分離的方案進行優化和標準化，以減少由于技術問題造成的變異。某些特定的mi RNA 參與了COPD 的發病機制，并能夠通過胞外囊泡傳遞系統傳遞到疾病部位，影響慢性炎癥進程[44-45]。它們可能成為治療COPD 的重要焦點，這將成為COPD 患者的福音。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突