兒童哮喘患者炎癥因子水平及肺功能變化與SOCS3基因多態性的相關性*

劉陽,朱永杰

1南陽市中心醫院兒科(河南南陽 473000)； 2鄭州兒童醫院急診科(河南鄭州 450053)

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發病機制涉及多種炎性細胞、炎性因子和炎性介質[1]。以氣道高反應性和黏液分泌過多為主要病理表現。世界各國的兒童哮喘的患病率成上升趨勢，尤其是年幼兒童[2]。我國兒科哮喘協會曾進行4次全國兒童哮喘患病率的調查，經過比較顯示我國兒童哮喘的患病率成逐年增加的趨勢[3-6]。因此早期診斷、合理治療和有效的預防，為減少兒童支氣管哮喘和并發癥發生具有重要意義。兒童支氣管哮喘與炎癥反應密切相關，血清檢測炎癥因子的水平有助于哮喘的診斷[7-11]。遺傳因素在哮喘的發生中也起到重要作用，細胞因子信號傳導抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)，參與許多信號通路的傳導，通過誘導炎癥因子和抗炎因子在炎癥性疾病中發揮重要作用[12-15]。本研究收集在我院小兒呼吸內科接受治療的124例兒童哮喘患兒，通過檢測SOCS3基因rs9914220和rs4969170位點，進一步分析SOCS3基因多態性與兒童哮喘的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2018年6月在我院小兒呼吸內科接受治療的124例兒童哮喘患兒，男73例，女51例，平均年齡(7.8±2.4)歲。患兒符合兒童支氣管哮喘的診斷與防治指南[1]，無其他過敏性疾病，無心臟、腎臟和肝臟等主要器官的功能障礙。未有合并精神疾病的和認知障礙的患兒。收集同時期來我院就診的健康兒童74例作為對照組，男39例，女35例，平均年齡(7.4±1.8)歲。無哮喘家族史和個人過敏史。本研究經過醫院倫理委員會批準，患兒家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 標本收集及檢測 入院時抽取空腹肘靜脈血5 mL，4 mL置于低溫(4℃)離心機中，1 500 r/min，離心15 min，吸取上層血清，至于EP管中，放于-80℃中保存待用。剩余1 mL為抽取DNA檢測實驗所用，放于-80℃中保存待用。所有檢測對象的血清收集完畢后，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測患者血清中白細胞介素(IL)-4、IL-7、IL-10、IL-17和IL-33的水平，具體的實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，ELISA試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。所有患者接受肺功能檢測，包括：1 s用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC百分比、最高呼氣流速(PEF)、殘氣量/肺活量(RV/TLV)。

1.3 全血基因組DNA抽提及基因多態性檢測 將保存的全血樣本，置于37℃水浴鍋中融化，按照美國Gentra公司提供的PUREGENE全血快速基因組DNA提取試劑盒中300 μL 全血提取基因組DNA的有機溶劑沉淀法進行抽提基因組DNA。抽提的DNA溶解于100 μL DNA水合液中，放置65℃水浴中1 h，然后檢測抽提基因組DNA的濃度和純度。通過Haploview軟件、文獻查閱等方法選擇SOCS3的SNP位點rs9914220和rs4969170，PCR 擴增及延伸引物由Array Designer 軟件設計，北京華大基因科技有限公司合成。rs9914220上游引物5′-CACCCCTGGTATGCACTGTGCCGTG-3′，下游引物5′-ACTGATTCTTGGGCAAGTTCAAATA-3′，rs4969170上游引物5′-ACTGGTACCTGGCTTCTCTCAGCCGGGGTC-3′,下游引物5′-CTAGCTAGCTAGGG-GGCGGCATGTAGTGGTG-3′，利用單核苷酸多態性基因分型檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)檢測選取位點的基因多態性。

2 結果

2.1 哮喘組與對照組患兒炎癥因子的水平和肺功能檢測比較 經過ELISA檢測結果顯示，哮喘組患兒外周血中IL-4、IL-7、IL-17和IL-33的水平明顯高于對照組，IL-10的水平明顯低于對照組，組間差異有統計學意義(P<0.001)，見表1。入院時兩組患兒檢測的肺功能指標如表2所示，哮喘組的通氣測定指標FEV1、FVC和PEF明顯低于對照組(P<0.001)，且FEV1/FVC比值也顯著低于對照組(P<0.001)，哮喘組肺容量檢測指標RV/TLV比值顯著高于對照組(P<0.001)。

表1 外周血中個炎癥因子的檢測水平

表2 對照組和哮喘組患兒肺功能檢測結果

2.2 SOCS3基因rs9914220和rs4969170位點各基因型頻率觀察值和期望值的比較 對照組和哮喘組SOCS3基因的rs9914220和rs4969170位點的各基因型頻率的觀察值和期望值比較差異無統計學意義(P>0.05),表明哮喘組和對照組各基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。見表3。

表3 哮喘組和對照組各基因型頻率觀察值和期望值的比較 例(%)

2.3 哮喘組和對照組SOCS3基因rs9914220和rs4969170位點基因型和等位基因頻率分布 rs9914220位點CC型、CT型和TT型在對照組中的檢出率分別為54.1%、28.4%、17.6%，在哮喘組中的檢出率為58.1%、14.5%、27.4%，CC和TT基因型分布在哮喘組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，而CT基因型在兩組之間差異有統計學意義(2=5.630，P=0.018)。rs4969170位點CC型、CT型和TT型在對照組中的檢出率分別為48.6%、31.1%、20.3%，在哮喘組中的檢出率為60.5%、15.3%、24.2%，CC和TT基因型分布在哮喘組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，而CT基因型在兩組之間差異有統計學意義(2=6.886，P=0.009)。兩組之間的等位基因頻率差異均無統計學意義，見表4。

2.4 對照組和哮喘組基因型單因素logistic回歸分析 Logistic回歸分析結果顯示CT基因與哮喘的發生呈負相關，CT基因為預防哮喘發生的保護性因素。見表5。

表4 哮喘組和對照組rs9914220和rs4969170位點基因型和等位基因頻率分布 例(%)

3 討論

兒童哮喘是較常見的兒科疾病，主要有白細胞介素、白三烯、T淋巴細胞和嗜酸性粒細胞引起的氣道炎癥反應[16]。在本研究中，哮喘組與對照組相比，IL-4、IL-7、IL-17和IL-33炎癥因子的水平升高，IL-10的水平降低。IL-4、IL-7和IL-17可誘導炎癥因子和趨化因子的表達，IL-33與其受體結合后可激活核因子-κB(NF-κB)和MAPK信號通路，從而調節炎癥反應[17-18]。IL-10對細胞的生長與分化有一定的調節作用，也可直接參與機體的炎癥反應和免疫應答，為目前公認的一種炎癥和免疫抑制因子[19]。因此，高水平的IL-4、IL-7、IL-17和IL-33和低水平的IL-10可以促進氣道高反應的形成，進而引發哮喘。因此，高水平的IL-4、IL-7、IL-17和IL-33和低水平的IL-10可以作為兒童哮喘的監測指標。在哮喘的發病過程中，長期的炎癥刺激有利于氣道的收縮，導致氣道狹窄[20]。在本研究中，哮喘組的通氣測定指標FEV1、FVC、FEV1/FVC比值和PEF明顯低于對照組，哮喘組肺容量檢測指標RV/TLV比值顯著高于對照組。哮喘組兒童有明顯的氣道功能障礙和氣流受限這與哮喘的病理特征相符合。因此肺功能的檢測在治療過程中可為哮喘的診斷和治療療效提供一定的參考依據。

表5 對照組和哮喘組基因型單因素logistic回歸分析

基因異常與兒童哮喘為近年研究的熱點，STAT6和TBXA2R基因多態性與哮喘發生風險無關，而與哮喘的臨床癥狀相關[21]。SOCS1、SOCS3 和SOCS5在哮喘患者中的水平有明顯的改變，SOCS3的變化較明顯，SOCS5的變化較小[22]。SOCS3為SOCS的家庭成員之一，位于染色體17q25.3包含225個氨基酸[23]。SOCS3通過誘導JAK的轉化激活劑1和3，參與JAK-STAY信號通路的傳導。已有研究顯示SOCS3可參與人體的炎癥反應、免疫應答及腫瘤的發生和轉移[24-26]。T細胞中SOCS3的表達上調與哮喘的嚴重程度相關，促進過敏反應[27]。在本研究中，我們主要針對SOCS3多態性基因位點rs9914220和rs4969170(C/T)的基因型和等位基因頻率的研究。結果顯示SOCS3基因rs9914220和rs4969170的CT有差異，logistic單因素方差分析結果顯示，CT基因為預防哮喘發病的保護性因素。綜上所述，SOCS3基因rs9914220和rs4969170位點的多態性與哮喘的發病有關，CT基因為預防哮喘發病的保護性因素。