孤養(yǎng)與束縛應激致腦缺血小鼠抑郁樣行為的性別差異*

鄭喬木，周琰，陳錚，潘美伯，任敏潔,袁琨,董銀鳳，丁惠南

南京中醫(yī)藥大學護理學院(江蘇南京 210023)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中最常見并發(fā)癥之一，嚴重影響患者的生活質量，并增加腦卒中的病死率[1]。目前研究認為PSD與下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)功能障礙及炎癥免疫等密切相關[2-3]。HPA軸激活后，促進下丘腦室旁核皮質激素釋放因子的表達增高，使腦垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic adrenocorticotropic hormone，ACTH)增多，最終使腎上腺皮質分泌糖皮質激素(皮質酮或皮質醇)增高，從而導致抑郁[4-5]。此外，炎癥反應也參與其中[6]。動物實驗和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，抑郁模型動物或患者的外周血中的炎癥因子——腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)增高[7-9]。敲除或抑制TNF-α或IL-1β可以減輕小鼠抑郁樣的行為[10-12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，性別差異是影響PSD發(fā)生及治療預后的重要因素[13-14]，但機制不明。因此，基于前期研究發(fā)現(xiàn)的基礎之上[15]，2016年12月至2018年3月，本研究應用成年雌雄小鼠建立PSD模型。通過分析與比較雌、雄小鼠的抑郁樣行為以及血清中的激素和炎癥因子水平，揭示PSD模型小鼠的性別差異，為闡明PSD性別差異的機制及其治療干預提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 100%蔗糖(國藥化工，上海)購自南京基易生物有限公司。皮質酮(CORT)試劑盒(貨號 KGE009，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)、促腎上腺皮質激素(ACTH)試劑盒(貨號CEA836Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)、TNF-α試劑盒(貨號 SEA133Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)和IL-1β試劑盒(貨號 SEA563Mu，Cloud-Clone Corp，Rockville，MD，USA)均購自南京迅貝生物有限公司。

1.2 實驗動物與分組 本研究分別應用36只2～3月齡C57/BL6j雌、雄小鼠，均購自南京青龍山動物繁殖中心。小鼠適應環(huán)境1周后，自由攝食和飲水，室溫維持在(22±2)℃，相對濕度50%～60%，光照/黑夜12 h交替。將雌、雄小鼠隨機分為正常對照組(Ctrl組)、腦缺血組(IR組)及腦缺血加孤養(yǎng)與束縛應激組(IRS組)，其中，雄性小鼠每組各12只，雌性小鼠每組各10只。

1.3 動物模型的制備

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注損傷模型 術前禁食4～6 h，小鼠經腹腔注射水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉。參照文獻[16]的方法，應用Longa改良法，先分離并阻塞頸總動脈，再分離小鼠的頸外動脈，將殘端離斷并在殘端剪開，將6-0硅膠包裹的線栓(6023PK，Doccol Corp，美國)從頸外動脈的缺口插入，經頸內動脈，至堵塞右側大腦中動脈。缺血1 h后，取出線栓，結扎頸外動脈缺口并松開頸總動脈，進行復灌。手術過程中小鼠的體溫均維持在36.5～37.0℃，術后自由攝食與飲水。

1.3.2 長期的孤養(yǎng)與束縛應激 參考文獻[17]的方法，將IRS組小鼠于手術前3 d開始孤養(yǎng)(1只/籠)，從腦缺血手術后第3天開始，將該組小鼠每天再給予2 h的束縛應激(放置于有透氣孔的50 mL離心管中)，并持續(xù)4周。

1.4 糖水偏愛試驗 蔗糖偏愛試驗是基于小鼠對甜味偏好這一特點，評價實驗動物的抑郁樣行為-即快感缺失。參照文獻[18]的方法，在為期3～7 d的實驗中，將小鼠給予雙瓶飲水，其中一瓶為1%蔗糖水，另一瓶為飲用水。在整個過程中隨機調換兩個水瓶的位置，以防止小鼠的位置偏愛效應。每天記錄小鼠飲用兩瓶液體的飲水量。通過計算小鼠對蔗糖偏愛率%=1%糖水的消耗量/(1%糖水的消耗量+純水消耗量)×100%。

1.5 曠場試驗 曠場試驗通常通過觀察小鼠在一定時間內，在曠場中心區(qū)域及周邊區(qū)域的活動情況，進而評價小鼠的焦慮樣行為。參照文獻方法[19]，將小鼠放入50 cm×50 cm×30 cm無色不透明的箱子中，其中心區(qū)25 cm×25 cm，小鼠在中心區(qū)域自由活動5 min，通過錄像及分析軟件Top Scan HR(Clever Sys Inc.，Reston，VA，USA)，記錄并小鼠在中心區(qū)的行走距離、停留時間和穿梭次數(shù)等。

1.6 強迫游泳試驗 該實驗是基于小鼠天生厭惡游泳的特點，通過分析小鼠水中游泳以尋找逃生路徑的方式，評價小鼠的“行為絕望”等抑郁樣行為。參考文獻方法[20]，將小鼠放置于15 cm×25 cm并盛水的圓柱桶中(水深14 cm，水溫24～26℃)6 min，應用 Scan RH(Clever Sys Inc.)軟件分析小鼠在水中后4 min的活動情況，比較不同組小鼠在水中的不動時間。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗 在孤養(yǎng)與束縛應激處理4周后，經腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用1 mL注射器經左心室抽取小鼠血液，室溫靜置2 h后，在4℃的低溫離心機(eppendoff，德國)中，按3 000 r/min轉速，離心20 min，分離上層血清，并保存于-80℃冰箱。檢測外周血清中CORT、ACTH、TNF-α和IL-1β的詳細操作步驟按照各個酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書的操作步驟進行，檢測試劑盒的詳細信息見1.1。

2 結果

2.1 長期的孤養(yǎng)與束縛應激引起腦缺血模型小鼠體重的顯著減輕 基礎狀態(tài)下，雄性各組小鼠的體重差異無統(tǒng)計學意義，隨應激處理時間的延長，各組小鼠體重增加的交互效應差異有統(tǒng)計學意義(F8，64=2.87，P=0.009)，并且時間的主效應差異有統(tǒng)計學意義(F4，32=38.30，P=0.00)；組間兩兩比較結果顯示，與Ctrl組相比較，雄性IRS組小鼠在腦缺血后給予孤養(yǎng)與束縛應激1周后出現(xiàn)顯著的體重減輕，而IR組無顯著變化，至應激后3周和4周，與IR組相比，IRS組小鼠體重仍顯著減輕(圖1-A)。基礎狀態(tài)下，雌性各組小鼠的體重差異無統(tǒng)計學意義，隨應激處理時間的延長，各組小鼠體重增加的交互效應無顯著差異(F8，40=1.97，P=0.076)，而時間的主效應差異有統(tǒng)計學意義(F4，20=6.60，P=0.001)，組間兩兩比較結果顯示，與Ctrl組相比，雌性IRS組小鼠分別在給予孤養(yǎng)與束縛應激1周和4周后出現(xiàn)顯著的體重減輕(圖1-B)。

注：A:雄性；B:雌性；與Ctrl組比較*P<0.05，**P<0.001；與IR組比較#P<0.05，##P<0.001

2.2 長期的孤養(yǎng)與束縛應激引起腦缺血模型小鼠糖水偏愛率的顯著降低 與相應的Ctrl組(86.18±3.65)相比，雄性IR組小鼠的糖水偏愛率(82.56±0.53)無顯著改變；而與Ctrl組和IR組相比，雄性IRS組小鼠在腦缺血后給予孤養(yǎng)與束縛應激4周后糖水偏愛率(61.0±10.22)顯著降低(F2，26=46.92，P<0.001)；雌性IR組小鼠(92.0±1.0)與Ctrl組(87.50±2.63)相比，糖水偏愛率的差異無統(tǒng)計學意義，而雌性IRS組小鼠的糖水偏愛率(59.67±5.40)較Ctrl組和IR組相比都顯著降低(F2，23=200.30，P<0.001)。見圖2。

注：A:雄性；B:雌性；*與Ctrl組比較P<0.001；#與IR組比較P<0.001

2.3 長期的孤養(yǎng)與束縛應激引起雌性腦缺血模型小鼠抑郁樣的行為表現(xiàn) 曠場實驗結果顯示，雄性各組小鼠在曠場中心區(qū)域的活動距離(圖3-A)(F2，26=0.86，P=0.43)、運動速度(圖3-C)(F2，26=0.93，P=0.40)、停留時間(圖3-E)(F2，26=0.16，P=0.85)及穿梭次數(shù)(圖3-G)(F2，26=1.22，P=0.31)均無顯著改變。雌性小鼠則不然，與Ctrl組相比，IRS組小鼠在曠場中心區(qū)域的活動距離(圖3-B)(F2，25=5.13，P=0.014)、運動速度(圖3-D)(F2，25=6.21，P=0.006)、停留時間(圖3-F)(F2，25=5.42，P=0.011)及穿梭次數(shù)(圖3-H)(F2，25=6.25，P=0.006 1)等均顯著減少。同樣，在強迫游泳實驗中，雄性小鼠各組之間的不動時間無顯著差異(圖4-A)(F2，26=0.91，P=0.42)；而與其Ctrl組(124.90±41.20)相比較，雌性IRS組小鼠的不動時間(182.90±28.18)顯著延長(圖4-B)(F2，25=3.89，P=0.034)。

2.4 腦缺血及長期的孤養(yǎng)與束縛應激能增強雄性小鼠的炎癥反應 與Ctrl組(71.92±38.42)相比，雄性IR組(191.40±56.39)和IRS組(170.60±77.60)小鼠外周血中TNF-α顯著升高(圖5-A)(F2，24=10.31，P=0.000 6)，同樣，與Ctrl組(9.38±5.45)相比，雄性IR組(40.74±12.44)和IRS組(35.16±7.43)小鼠外周血中IL-1β也顯著升高(圖5-C)(F2，24=31.53，P<0.0001)。但是，雌性各組小鼠外周血中TNF-α(F2，24=2.61，P=0.095)和IL-1β(F2，24=0.19，P=0.83)差異均統(tǒng)計學意義。見圖5。

注：A、C、E、G:雄性；B、D、F、H:雌性；*與Ctrl組比較P<0.05

注：A:雄性；B:雌性；*與Ctrl組比較P<0.05

注：A、C：雄性；B、D：雌性；與Ctrl組比較*P<0.01，**P<0.001

2.5 長期的孤養(yǎng)與束縛應激引起腦缺血模型小鼠激素水平的改變 與Ctrl組(21.63±22.21)和IR組(24.48±19.59)相比，雄性IRS組(57.79±31.77)小鼠的外周血血清中CORT的水平顯著增高(圖6-A)(F2，24=5.79，P=0.008 9)，而ACTH無顯著變化(圖6-C)(F2，24=0.34，P=0.71)。與Ctrl組(14.47±8.08)相比，雌性IRS組(36.81±29.05)小鼠外周血血清中的CORT升高；并且與Ctrl組(187.10±50.84)和IR組(195.60±59.93)相比，IRS組(306.90±38.09)小鼠外周血中ACTH均顯著升高(F2，24=15.81，P<0.000 1)。見圖6。

注：A、C：雄性；B、D：雌性；與Ctrl組比較*P<0.05，**P<0.001；與IR組比較#P<0.05，##P<0.001

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組和IR組相比，IRS組雌、雄小鼠均出現(xiàn)顯著的體重減輕和糖水偏愛率的降低；通過曠場實驗和強迫游泳實驗等行為學測試，雌性IRS組小鼠表現(xiàn)更為顯著的焦慮與抑郁樣的行為，并且外周血中CORT和ACTH的水平也顯著增高；而雄性IRS組小鼠外周血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β以及CORT均顯著增高，其他變化不顯著。因此，研究結果表明長期的孤養(yǎng)和束縛應激引起腦缺血小鼠抑郁樣行為，并且雌性小鼠更加易感，性別反應差異的機制可能與炎癥及下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)有關。

炎癥是腦卒中和抑郁的重要病理機制。腦缺血后數(shù)小時即可誘發(fā)腦內的炎癥反應，并且可持續(xù)數(shù)周[21]。炎癥反應不僅加重腦缺血和抑郁的癥狀，并且對疾病的發(fā)生及預后也產生重要的影響[22]。基礎和臨床研究均發(fā)現(xiàn)，抑郁后的炎癥與免疫反應具有性別差異，炎癥在抑郁中的作用在雄性表現(xiàn)更加明顯，炎癥反應的程度與抑郁的癥狀呈正相關[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后給予長期的孤養(yǎng)和束縛應激促進雄性小鼠外周血中致炎因子TNF-α和IL-1β顯著增高，而降低糖水偏愛率。但IRS組雌性小鼠外周血中TNF-α和IL-1β并無顯著差異，此差異的形成可能與性激素的作用有關。研究發(fā)現(xiàn)雌激素減輕應激誘導雌性小鼠體內的炎癥反應[25]。此外，也與應激引起HPA軸的激活導致皮質酮的增高有關。CORT是調節(jié)體內炎癥反應的重要激素之一，能夠減輕炎癥反應[26]。本研究結果顯示雌性IRS組小鼠外周血中CORT和ACTH水平顯著增高，提示長期的孤養(yǎng)與束縛應激顯著激活雌性腦缺血小鼠的HPA軸。

研究發(fā)現(xiàn)HPA軸的反應具有性別差異[27]。CORT/皮質醇增高是HPA軸激活的重要參考指標。CORT調節(jié)機體對應激的反應，包括情緒反應和生理反應。皮質酮的含量與應激反應有關，CORT輕度增高增強機體對應激反應的適應性行為，而CORT的大量增高與抑郁的形成有關[28]。本研究發(fā)現(xiàn)長期的孤養(yǎng)和束縛應激能促進雌、雄腦缺血小鼠外周血中CORT的增高，但雌性小鼠外周血中的ACTH也增高。以往研究也表明，雌性小鼠在慢性應激反應后，外周血中CORT和ACTH水平較雄鼠更高[13]，并且腦內激素相關的受體表達也上調[29]。因此，研究表明長期的孤養(yǎng)和束縛應激促進雌性腦缺血小鼠HPA軸的持續(xù)激活。一方面，與女性的生理特性，如激素水平有關。另一方面，與女性的性格等心理因素也有一定的關系，女性天生敏感、細膩，易焦慮等[30]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)長期的孤養(yǎng)和束縛應激引起2～3月齡小鼠卒中后抑郁的形成具有性別差異，與炎癥反應及HPA軸的激活有關。此研究結果為闡明卒中后抑郁的性別差異性的機制及治療提供理論基礎。后續(xù)將繼續(xù)深入闡明其作用機制并尋找適宜的治療干預措施。