桑葚酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究

黃 彭 ，胡 森 ，舒 琳 ，秦 文 ，賴小嬌 ，吳 芳 ，2

（1.宜賓學院質量管理與檢驗檢測學部，四川 宜賓 644000；2.宜賓學院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625000）

桑葚又名桑烏、桑果、桑棗，屬桑科（Moraceae）桑屬（Morus L.）桑種（Morus alba L.）[1]，含有豐富的營養(yǎng)成分，如糖類、胡蘿卜素、VA、VB1、VB2、VC、有機酸、人體所需的18 種氨基酸，鈣、磷、銅、鋅等礦物質元素[2-3]，以及各種活性成分，如花青素[4-5]、多糖[6]、多酚[7]、白藜蘆醇[8]，有“民間圣果”[9]、“中華果王”之美稱[10]。在醫(yī)學上，桑葚可增益肝腎、滋養(yǎng)血液產生益生因子，具有多種保健功能，可增強人體免疫力，促進新陳代謝，屬藥食同源植物，深受廣大消費者喜愛[11-12]。宜賓氣候溫和，現有桑園3.2 萬hm2，位居四川省第二[13-14]。桑果柔軟多汁，采摘期較短，貯運中易損傷腐爛變質，造成巨大的經濟損失，影響其產業(yè)可持續(xù)發(fā)展[15]。因此對桑果進行加工處理，減少果農經濟損失，增強桑葚產品市場競爭力勢在必行。本文以宜賓桑葚為原料，研究了桑葚酒發(fā)酵工藝條件，并對其芳香物質進行測定，獲得桑葚酒的最佳發(fā)酵工藝，以期為桑葚酒的開發(fā)提供科學依據，為提高桑葚加工附加值和促進城鄉(xiāng)經濟發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

桑葚：購于宜賓安阜農貿市場；白砂糖：購于宜賓綠源超市；活性干酵母EC118、DV10 和KD：法國拉曼集團產品，購于上海杰兔工貿有限公司，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室保藏。蛋白胨、瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司產品；其余化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備

5975C-7890A 型氣相色譜-質譜聯用儀，T6 型新世紀紫外可見分光光度計，TGL-16GB 型高速離心機，LDZX-75KBS 型高溫濕熱滅菌鍋，JJ060387 型超凈工作臺，DH1008 型水浴鍋，Hei-VAP Precision 型旋轉蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 清洗、榨汁

選擇新鮮無病變無腐爛的桑葚，去果柄，清水洗凈，打漿（固液比為 1∶1.5（g/mL））于 4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2.2 成分調整

添加焦亞硫酸鈉調整SO2的濃度[17]，添加白砂糖調整糖含量，并用檸檬酸調整至pH 4.0，常溫靜止放置10 h。

1.2.2.3 酵母活化

取活性干酵母 EC118、DV10、KD 各 1 g，分別加入10 mL 2%葡萄糖溶液中，35 ℃恒溫水浴40 min 溶化。移取1 mL 酵母液于100 mL 滅菌后的YPD 液體培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%葡萄糖，2%蛋白胨，自然pH，在121 ℃下高壓滅菌20 min）[18]中35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，采用顯微鏡計數，調整菌種數為1×107CFU/mL，置于4 ℃冰箱中備用[19]。

1.2.2.4 主發(fā)酵

接入活化好的酵母菌種液，恒溫發(fā)酵7 d。

1.2.2.5 陳釀、過濾

原酒在15 ℃陳釀5 個月，經離心過濾除去酒中的膠體、蛋白質等成分，取上清液，制得桑葚發(fā)酵原酒[20]。

1.2.2.6 調配

根據桑葚發(fā)酵酒的酒精度、含糖量、總酸等指標，用桑葚發(fā)酵原酒、白砂糖和檸檬酸等進行調配，使之符合發(fā)酵酒的品質要求。

1.2.2.7 滅菌

調配后的桑葚發(fā)酵酒進行罐裝，放入溫度為70 ℃水浴鍋中，殺菌30 min[21]。

1.2.2.8 冷卻

冷卻至室溫后，放在陰涼通風處保存。

1.2.3 單因素試驗設計

1.2.3.1 發(fā)酵菌種的篩選

量取40 mL 桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，調整初始糖度為180 g/L，添加焦亞硫酸鈉調整SO2濃度為70 mg/L，靜置10 h 后，分別接種5%活化后的EC118、DV10、KD 酵母菌種液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 待發(fā)酵結束后，以桑葚發(fā)酵酒的殘?zhí)橇亢途凭葹橹笜耍Y選出適合桑葚發(fā)酵的菌株，作為試驗后續(xù)發(fā)酵用菌種。

1.2.3.2 酵母接種量對發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，調整SO2含量為70 mg/L，靜置10 h 后，分別接種3%、5%、7%、9%和11%活化好的KD 酵母菌種液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜耍Y選出合適桑葚酒發(fā)酵的酵母接種量。

1.2.3.3 初始糖度對發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖分別調節(jié)桑葚汁初始含糖量分別為140、160、180、200、220 g/L，調整 SO2含量為 70 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后KD 酵母菌種，接種量為5%，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜耍Y選出合適桑葚酒發(fā)酵的初始糖度。

1.2.3.4 SO2濃度對發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，分別調整 SO2濃度分別為 30、50、70、90、110 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后KD 酵母菌種，接種量為5%，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜耍Y選出合適桑葚酒發(fā)酵的SO2濃度。

1.2.3.5 溫度對發(fā)酵的影響

量取40 mL 處理好的桑葚果汁于250 mL 錐形瓶中，用白砂糖調節(jié)桑葚汁初始含糖量為180 g/L，調整SO2濃度為70 mg/L，靜置10 h 后，接種活化后酵母菌種，KD 接種量為 5%，分別置于 20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。完成發(fā)酵后，以桑葚酒的酒精度和殘?zhí)橇繛橹笜耍Y選出合適桑葚酒發(fā)酵的溫度。

1.2.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選定初始糖度、SO2濃度、酵母接種量、發(fā)酵溫度為主要影響因素，每個因素3個水平，以殘?zhí)呛亢途凭葹榭疾熘笜耍M行L9(34)正交試驗[22]，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 測定項目與方法

1.2.5.1 殘?zhí)橇?/p>

采用3，5-二硝基水楊酸法[23]測定。以吸光度為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，獲得總糖的標準曲線：y=1.09x-0.027，R2=0.995。

1.2.5.2 酒精度

使用100 mL 量筒量取50 mL 桑葚酒樣品并倒入蒸餾瓶中，用50 mL 蒸餾水將量筒洗滌3 次，并將洗滌液全部加入蒸餾瓶中。打開冷凝水，加熱至70 ℃開始蒸餾，用100 mL 容量瓶收集餾出液接近刻度線時，停止加熱。再用全自動密度折光儀測定酒精度[24]。

1.2.5.3 香氣成分

采用GC-MS 聯用法進行檢測[25-26]。色譜檢測條件參考游玲等[27]的方法，使用Lzp930 色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純 N2，升溫程序：55 ℃保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升溫至 150 ℃，保持 1 min，再以10 ℃/min 升溫至 170 ℃，保持 3 min，再以 10 ℃/min升溫至220 ℃，保持20 min。進樣溫度220 ℃，檢測溫度 250 ℃，進樣量 0.4 μL，分流比 10∶1。質譜條件[28]：電子轟擊離子源（EI），溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；掃描質量范圍35~400 m/z。利用NIST 11.L 標準質譜庫進行對比，按峰面積歸一化法求得各成分相對質量分數。

1.2.5.4 感官品質評價

邀請食品專業(yè)的老師和接受過品酒技能培訓的同學共10 名，對桑葚酒的色、香、味等進行綜合感官評分，感官評分標準設計[29-31]如表2 所示。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.6 數據處理

采用Excel 2016 和SPSS 24.0 軟件進行統計分析和數據處理。

2 結果與分析

2.1 酵母菌種對桑葚酒發(fā)酵的影響

菌種的品質直接影響桑葚酒的發(fā)酵效果，接種發(fā)酵7 d 后桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭热鐖D1 所示，3 種菌種發(fā)酵桑葚的能力不相同，其中KD＞DV10＞EC110。KD 酵母發(fā)酵后的酒精度顯著高于其余兩株菌種（P＜0.05），EC118 和 DV10 菌種的酒精度差異不顯著。KD 酵母發(fā)酵能力較強，其酒精度最高達到10.87%Vol，殘?zhí)橇孔畹停瑸?.92 g/L。因此桑葚發(fā)酵的優(yōu)勢菌種為KD 酵母。

圖1 不同菌種對桑葚發(fā)酵酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.1 Effects of different strains on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.2 酵母接種量對桑葚酒發(fā)酵的影響

由圖2 可見，當酵母接種量為3%時，發(fā)酵酒樣品中的酒精含量低，殘?zhí)呛扛哌_1.905 g/L，說明接種量偏少時，酵母細胞增殖緩慢，導致發(fā)酵進程緩慢，對發(fā)酵體系中糖等發(fā)酵基質的利用不高，發(fā)酵不徹底。酵母接種量為5%~7%時，殘?zhí)呛肯鄬p小，其中當接種量為5%時，發(fā)酵酒樣中酒精度達到最高（11.98%），這主要是隨著接種量的增加，酵母細胞增殖迅速，發(fā)酵迅速，發(fā)酵系統糖消耗快，發(fā)酵過程溫和，有利于酒精的積累和芳香物質的形成。接種量超過7%后，殘?zhí)橇康淖兓鄬π。凭坎町惔螅饕且驗楫斀臃N量大時，酵母細胞大量繁殖，發(fā)酵系統中的營養(yǎng)物質消耗迅速，不利于發(fā)酵過程中芳香物質的形成和積累，而且大量的代謝產物和次生代謝產物都會對發(fā)酵造成污染。所以選桑葚果酒發(fā)酵的酵母接種量為5%。

圖2 酵母接種量對桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.2 Effects of yeast inoculations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.3 初始糖度對桑葚酒發(fā)酵的影響

由圖3 可知，在整個桑葚發(fā)酵過程中，隨著初始糖含量的增加，桑葚酒中的酒精含量也隨之增加。初始糖度為140~160 g/L 時，發(fā)酵后的殘?zhí)橇肯鄬^少，酒精度較低，酒味清淡，桑葚風味不明顯；初始糖度為180 g/L 時，酒樣酒精度較高，達到11.79%，酒體風味濃郁；當初始糖度為200 g/L 和220 g/L 時，殘?zhí)橇肯鄬^高，酒精度變化明顯，酒體口感偏甜。說明偏高的初始糖度可能影響了酵母的生產代謝，抑制了發(fā)酵過程中酒精的積累。所以選桑葚果酒發(fā)酵的初始糖度為180 g/L。

圖3 初始糖度對桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.3 Effects of initial sugar contents on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.4 SO2 濃度對桑葚酒發(fā)酵的影響

適量SO2能夠有效地抑制雜菌生長，促進果酒發(fā)酵順利進行的同時還具有抗氧化等作用。但SO2過量不僅使酒的品質變劣，還易對人體健康造成危害[17]。由圖4 可知，隨著SO2濃度的增加，殘?zhí)橇吭黾樱凭日w呈下降趨勢，并帶有刺激性氣味。可能是由于SO2的增酸作用，抑制了酵母菌株的生長，對糖的消耗能力減弱。當SO2濃度為30 mg/L 時，桑葚酒中殘?zhí)呛孔畹停凭葦底罡撸葡爿^濃郁，且刺激性氣味可以忽略不計。所以選擇SO2濃度為30 mg/L 作為桑葚酒發(fā)酵的添加濃度。

圖4 SO2 添加量對桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.4 Effects of SO2 concentrations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.5 發(fā)酵溫度對桑葚酒發(fā)酵的影響

適宜的發(fā)酵溫度對酵母的活性及香味物質形成具有重要作用。當溫度較低時，酵母生長快，但發(fā)酵速度慢，導致發(fā)酵周期延長；當溫度較高時，發(fā)酵速度快，但容易損失香味物質[32]。如圖5 所示，當發(fā)酵溫度低于25 ℃時，由于酵母細胞生長緩慢，糖利用率低，導致酒精積累少而殘?zhí)橇扛撸划敎囟瘸^25 ℃時，酵母生長可能受到抑制，導致發(fā)酵動力不足，殘?zhí)橇扛呔凭鹊停阄段镔|降低；當溫度控制在25 ℃時，發(fā)酵效果好，發(fā)酵過程平穩(wěn)且徹底，殘?zhí)橇孔畹停瑸?.65 g/L，酒精度最高，為11.57%。所以選擇25 ℃為桑葚酒的發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對桑葚酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊慒ig.5 Effects of fermentation temperatures on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.6 正交試驗結果

由表3 可見，以酒精度為考察指標，影響桑葚酒發(fā)酵工藝各因素的主次順序為：A＞C＞B＞D；最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C3D2，即初始糖度180 g/L，酵母接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度25 ℃。以感官品質為考察指標，影響桑葚酒發(fā)酵工藝各因素的主次順序為：D＞A＞B＞C；最佳發(fā)酵工藝條件為A2B2C3D3，即初始糖度180 g/L，接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度27 ℃，由于D2和D3的感官品評分差異不顯著（P=0.876＞0.05），在實際操作中可忽略其影響，因此溫度選擇25 ℃。在A2B2C3D2條件下進行3 次驗證試驗，制得桑葚酒感官品質得分為81.7±1.24 分，酒精度為12.09%±0.16%，色澤明亮、無異雜味；風格良好，具有桑葚獨特的滋味，更容易讓人接受。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results

2.7 香氣成分檢測結果

利用GC-MS 法對最優(yōu)條件下發(fā)酵的桑葚酒進行香氣成分分析，得離子峰圖6。由圖6 可以看出，各揮發(fā)性物質的保留時間差異很大，大部分物質在1~10 min 內出現，其中甲醇、乙醛、乙醇等主要集中在5 min 左右，異戊醇、糠醛等的保留時間相對較長，在14 min 后。

圖6 離子峰圖Fig.6 Diagram of ion peak

由表3 可見，檢測出相對質量分數大于1%的化合物共11 種，這些物質的存在，賦予了桑葚酒特有的香氣與風味。其中乙醇的含量最高，甲醇和兩種酯類物質相對含量較少；酯類物質賦予桑葚酒果香、花香；苯乙醇和異丁醇的含量相對較高，其中苯乙醇屬于芳香醇類，是酵母的代謝產物，其感官閾值相對較低，所以香氣值很高[33]，它們?yōu)樯］鼐铺峁┝颂厥獾娘L味。

表3 香氣成分檢測結果Table 3 Test results of aromatic substances

3 結論

本研究以宜賓本地產刺桑葚為原料，經單因素試驗和正交試驗優(yōu)化桑葚發(fā)酒工藝條件。結果表明，桑葚酒最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度180 g/L，KD 酵母接種量5%，SO2濃度40 mg/L，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間7 d。在此工藝條件下發(fā)酵出的桑葚酒，酒精度為12.09%±0.16%，感官得分81.7±1.24 分。利用GC-MS 聯用檢測出發(fā)酵酒主要香氣物質為：醇類6種，醛類3 種，酯類2 種，這些化合物賦予了桑葚酒獨特的風味。