響應面優化超聲輔助法提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究

賈 娟 ，王婷婷 ，傅 航 ，楊雯雯

（1.河南工業大學漯河工學院，河南 漯河 462002；2.漯河職業技術學院，河南 漯河 462002）

杜仲（Eucommia ulmoids）又名木棉、思仲，屬杜仲科（Ecommiaceae）落葉喬木植物，是我國特有的經濟樹種和特有藥材，在《神農本草經》和《本草綱目》中對其藥用功能都有記載[1]。杜仲具有利尿、消炎、促消化、降血壓等功效。一般栽培10～20 年杜仲采用半剝法和環剝法可得到杜仲樹皮，經2～3 年后樹皮才能重新長成，而杜仲葉價格低廉，比較容易獲得[2]。有研究表明，杜仲葉也具有與杜仲基本相同的藥用功效，且杜仲葉中也富含綠原酸、黃酮和環烯醚萜類物質等，其綠原酸含量十分豐富，可達1%～5%[3-6]。綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、升高白血球、保肝利膽、抑制突變和抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗自由基和抗衰老等作用[7]。

杜仲葉中綠原酸的提取方法包括微波輔助提取法、回流提取、超聲波提取法等。微波輔助提取法是利用微波熱效應加快綠原酸溶解的一種提取方法，具有快速、高效、加熱均勻和操作簡單的特點，但同時具有不易自動化的缺點；回流提取法是利用加熱回流裝置將有機溶劑揮發，而活性成分被提取的一種方法，具有選擇性、能耗低、操作簡單的優點，但也存在效率較低、耗時等缺點；超聲輔助提取主要利用空化效應、機械效應和熱效應使植物細胞被破壞，用有機溶劑將胞內活性物質提取出的一種方法，具有提取時間短、溫度低、雜質少、提取率高、范圍廣且能避免胞內物質損失等優點，所以本研究選擇超聲波法提取杜仲葉中綠原酸。

近些年，國內外已經出現很多提取杜仲中綠原酸的研究，如鄧愛華等[7]、任小寧等[8]、張蕾等[9]、趙亞洲等[10]分別采用了溶劑萃取、酶法、超聲波法和微波法進行提取，以上的方法普遍對溶劑的濃度、料液比、時間等因素進行優化，影響綠原酸提取率的重要因素并不全面，如液料比、乙醇濃度、提取時間、溶劑pH、提取次數沒有同時考慮，尤其是響應面超聲波提取杜仲葉中綠原酸的研究鮮有報道。為此，本試驗采用響應面法優化超聲波輔助提取杜仲葉中的綠原酸，對超聲波提取的重要條件同時進行優化，更加系統全面地確定超聲波法提取杜仲葉中綠原酸的參數，以期為合理開發利用杜仲資源及綠原酸產品的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

杜仲葉：采于河南省南陽市；綠原酸標準品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司產品；無水乙醇（分析純）：開封市鐵塔試劑廠產品；氫氧化鈉、鹽酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠產品。

1.1.2 儀器與設備

TGL-16G 型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-2600 型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA2004 型電子天平：上海上平儀器有限公司；PHS-3CT 型酸度計：上海康儀儀器有限公司；304 不銹鋼材質2500c 型粉碎機：永康市艾澤拉電器有限公司；200 mm 60 目標準型分樣篩：上虞市新達凈化儀器廠；202 型電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫療儀器廠；SB-800D 型超聲波發生器：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

新鮮杜仲葉經過采摘后，自然晾干，置于50 ℃電熱恒溫干燥箱中12 h，用粉碎機將烘干的樣品粉碎后過60 目篩，備用。

1.2.2 綠原酸超聲波輔助提取工藝

準確稱取等量的杜仲葉，加入不同濃度的乙醇，設置好不同的液料比。調整設定pH，通過設定提取時間和提取的次數，對杜仲葉中綠原酸進行超聲波提取[11-12]。

1.2.3 綠原酸超聲波輔助提取單因素優化試驗

1.2.3.1 液料比的篩選

分別設定pH 為7.0 的70%乙醇溶液與杜仲葉粉末的液料比為 10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1（mL/g）（如：液料比為 10∶1（mL/g）是指 10 mL 提取液，1 g 杜仲粉末）提取20 min，研究不同液料比對綠原酸提取率的影響。

1.2.3.2 提取液乙醇濃度的篩選

準確稱取1.000 g 的杜仲葉粉末，加入pH 為7.0的 10 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，提取20 min，研究不同濃度乙醇對綠原酸提取率的影響。

1.2.3.3 提取時間的篩選

準確稱取1.000 g 的杜仲葉粉末，加入10 mL 70%的乙醇溶液，調整 pH 為 7，分別提取 5、10、20、30 min，研究不同提取時間對綠原酸提取率的影響。

1.2.3.4 溶劑pH 的篩選

準確稱取1.000 g 的杜仲葉粉末，加入10 mL pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的 70%乙醇溶液，提取20 min，研究不同pH 對綠原酸提取率的影響。

1.2.3.5 提取次數的篩選

準確稱取1.000 g 的杜仲葉粉末，加入pH 為7.0的10 mL 70%的乙醇溶液，提取設定的次數分別為1次、2 次、3 次、4 次和 5 次，每次提取 20 min，研究提取次數對綠原酸提取率的影響。

1.2.4 響應面優化試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以料液比、乙醇濃度、提取時間和提取pH 為考察因素，以綠原酸提取率（Y）為響應值，利用Design Expert 8.0.6 軟件進行4 因素3 水平試驗，優化超聲波法提取杜仲葉中綠原酸的工藝。試驗水平編碼如表1 所示。

1.2.5 綠原酸含量的測定

1.2.5.1 綠原酸標準曲線的制備

精確稱取綠原酸標準品0.02 g，用60%乙醇溶解并定容至100.00 mL 的容量瓶中，即得到0.200 mg/mL的標準液待用。準確移取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL 標準液于 10.00 mL 的比色管中，用30%的乙醇定容至刻度，得到系列濃度為0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、280.0 μg/mL 的標準液，搖勻后在紫外可見分光光度計330 nm 處測定其吸光值。測定標準曲線為：y=0.004 7x+0.001 5，R2=0.999 9，結果見圖1。

表1 響應面試驗水平編碼表Table 1 Factors and levels for response surface test

圖1 綠原酸標準品標準曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

1.2.5.2 綠原酸含量

精確稱取已處理的杜仲葉粉1.000 g，通過設定方法提取綠原酸，移取0.1 mL 提取液，用30%乙醇定容至10 mL，搖勻后在紫外可見分光光度計330 nm處測定其吸光值。根據以下公式計算不同試驗組杜仲葉提取物綠原酸提取率。

Y=c×V×10×1 000/m

式中：Y 為綠原酸提取率，%；c 為測定液中綠原酸的濃度，mg/mL；V 為綠原酸浸提液體積，mL；m 為杜仲葉原料的質量，g。

1.2.6 數據處理

使用Excel 2007 對數據進行分析并繪制圖表，并利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉中綠原酸超聲波輔助提取單因素試驗

2.1.1 液料比對杜仲葉中綠原酸提取率的影響

由圖2 可以看出，綠原酸提取率隨著溶劑量的增加先增加后緩慢減少，當液料比為 16∶1（mL/g）時，綠原酸提取率達最高，此后繼續增加溶劑，綠原酸提取率趨于穩定并略有下降，說明在一定范圍內，綠原酸含量隨著溶劑增加而增加，而當綠原酸全部被溶解出即其提取率達到最大值后，再增加溶劑量反而導致綠原酸提取率下降[13]。此外，溶劑添加量過大，會增加成本，故選擇液料比為 16∶1（mL/g）。

圖2 不同液料比對杜仲葉綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.2 乙醇濃度對杜仲葉中綠原酸提取率的影響

由圖3 可以看出，綠原酸提取率隨著乙醇濃度的增加先升高后緩慢降低，當乙醇濃度為50%時，綠原酸提取率為最高，此后繼續增加提取液乙醇濃度，綠原酸提取率開始緩慢下降。這可能是由于杜仲葉中脂溶性物質在高于50%乙醇提取液被溶解出，而造成綠原酸的提取率緩慢下降[14]。故選取溶劑中乙醇濃度為50%左右。

圖3 不同提取液乙醇濃度對杜仲葉綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.3 提取時間對杜仲葉中綠原酸提取率的影響

由圖4 可以看出，隨著提取時間的延長，綠原酸提取率在設定的時間內迅速升高，在20 min 以后基本保持穩定。提取時間越長，綠原酸提取率越高，但到達一定時間，杜仲葉中的綠原酸提取達到飽和。同時，延長提取時間，成本提高，溶劑的逸失也會增加。故選擇超聲浸提時間20 min 左右。

圖4 不同超聲浸提時間對杜仲葉綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.4 溶劑pH 對杜仲葉中綠原酸提取率的影響

由圖5 可以看出，綠原酸提取率在設定的溶劑pH 范圍內呈現先升高后緩慢降低的趨勢，pH 為5時，提取率達到最高。這可能是由于在酸性環境中綠原酸較穩定[15]，故選擇溶劑pH 為5 左右。

圖5 不同溶劑pH 對杜仲葉綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of solvent pH on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.5 提取次數對杜仲葉中綠原酸提取率的影響

由圖6 可以看出，綠原酸提取率隨著提取次數的增加依次升高，但是當提取次數大于3 時，所得浸提液的吸光值基本不變，也就是提取率趨于穩定。此外，浸提次數太多，也會增加成本和影響綠原酸的提取效果。故選擇浸提次數為3 次。

圖6 不同浸提次數對杜仲葉綠原酸提取率的影響Fig.6 Effect of leaching times on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.2 杜仲葉中綠原酸超聲波輔助提取響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計

利用Box-Behnken 設計原理對杜仲葉中綠原酸超聲波輔助提取工藝參數進行優化，試驗設計及結果如表3 所示。

表3 Box-behnken 試驗設計及結果Table 3 Test design and results of Box-behnken method

2.2.2 回歸模型方差分析及顯著性檢驗

以提取率Y 為響應值，液料比X1、乙醇濃度X2、提取時間X3、溶劑pH X4為自變量，建立的二次回歸方程：

對響應面回歸模型進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4 可見，回歸模型的F=13.76，P＜0.000 1，表明超聲波法提取綠原酸提取率與4 個因素之間的回歸方程極顯著[16]。因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.932 2），調整確定系數說明可解釋86.45%相應值的變化，模型失擬項0.108 7＞0.05，不顯著，擬合程度好，表示單因素試驗結果可以和數學模型模擬良好。一次項X1、X2及二次項的 P 值均小于0.001，達到極為顯著水平，表明這些因素對綠原酸提取率的影響極大，且考察因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。F 值表示的是液料比、乙醇濃度、浸提時間、溶劑pH 這4 個因素對綠原酸提取率的影響程度，F 值越大，說明影響程度越大[17]，可見4 個因素對綠原酸提取率的影響表現為：X2＞X1＞X4＞X3，即乙醇濃度＞液料比＞提取液pH＞提取時間。

2.3 多因素交互作用的響應曲面分析

圖7 液料比與乙醇濃度的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and ethanol concentration interaction on chlorogenic acid extraction rate

一般來說，等高線圖呈橢圓狀時表示兩因素間的交互作用顯著，圓形則相反[18-19]。圖7~12 是超聲波法提取綠原酸的4 個因素之間交互作用的響應面圖。由圖7~12 可知，在試驗所選擇的水平范圍內，4 個因素之間的交互作用對綠原酸提取率的影響相似，基本都隨著交互因素添加量的增加達到最大值后又降低，其中液料比和乙醇濃度（X1X2）、液料比和溶劑pH（X1X4）、提取時間與溶劑 pH（X3X4）之間的交互作用較明顯，這與方差分析的結果相符。

圖8 液料比與浸提時間的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and extraction time interaction on chlorogenic acid extraction rate

圖9 液料比與溶劑pH 的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

圖10 乙醇濃度與提取時間的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plot of effect of ethanol concentration and ultrasonic time interaction on chlorogenic acid extraction rate

根據所得到的響應面模型，經Design-Expert 8.0.6 軟件處理得到最優工藝為：液料比 16∶1（mL/g），乙醇濃度50%，浸提時間20 min，溶劑pH 5，在此條件下綠原酸提取率為6.338%。同時，在此條件下進行3 組驗證試驗，綠原酸提取率分別為6.34%、6.36%、6.29%，取平均值為6.33%，與理論值較為接近，表明響應面模型對優化綠原酸的提取工藝可行。

圖11 乙醇濃度與溶劑pH 的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.11 Response surface plot of effect of ethanol concentration and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

圖12 提取時間與溶劑pH 的交互作用對綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.12 Response surface plot of effect of ultrasonic time and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

3 結論

本研究在單因素試驗結果的基礎上，通過響應面法優化了超聲輔助法提取杜仲葉綠原酸工藝，結果表明，杜仲葉綠原酸最佳提取條件為：液料比16∶1（mL/g），乙醇濃度 50%，浸提時間 20 min，溶劑pH 5，在此條件下綠原酸提取率為6.338%。同時在最優工藝條件下重復3 次驗證試驗，平均值為6.33%，與理論值較為接近，表明超聲波輔助技術對杜仲葉中綠原酸進行提取是可行的，提取率較高，這為綠原酸的提取純化工藝提供了參考，也為綠原酸相關產品的開發和利用提供了理論依據。