黑松松針多糖的復合酶法提取及其抑菌性研究

謝 瑋 ，郭宗明 ，葛勝菊 ，肖 川 ，陳 靜

（1.煙臺南山學院健康學院，山東 煙臺 265713；2.煙臺南山學院工學院，山東 煙臺 265713）

黑松是我國重要的景觀造林植物之一，松針是松科植物的針葉，是松樹重要的副產物之一，富含多種活性成分，如黃酮、木脂素、莽草酸、揮發油、多糖等[1]。松針的食用、藥用價值歷史悠久。徐瑞等[2]研究證實，在飼料中添加2%松針粉等量替代麩皮或直接添加2%松針粉均有提高生豬生長性能、降低咳嗽發生、提高機體免疫的效果。周思杰等[3]采用超聲波酶法優化雪松松針多糖的提取工藝，并證實提取的松針粗多糖有較好的抗氧化性。將松針中的生物活性成分進行提取后再添加到飼料中，有利于提高禽畜飼料轉化率，改善動物的免疫機能，提高經濟效益。目前，松針多糖的提取工藝有水提法、酸提法、堿提法、超聲法、微波法等[4-5]。本文采用分步加酶法研究復合酶法提取黑松松針多糖的工藝，并與同步加酶法進行比較，優化提取工藝，以期為提取黑松松針多糖的工藝優化提供一定的參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

黑松松針，采自煙臺南山學院東海校區。纖維素酶，酶活力≥105U/mg，購于和氏璧生物工程有限公司；果膠酶，酶活力≥2×104U/mg，購于上海藍季科技發展有限公司；石油醚、無水乙醇、檸檬酸、磷酸二氫鈉、葡萄糖、硫酸等試劑均為分析純。試驗用水均為蒸餾水。大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均由本校食品系微生物試驗室提供。

1.1.2 儀器與設備

800 T 型粉碎機，永康市榮浩工貿有限公司；GZX-9240MBE 型恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業有限責任公司；FA2004 型電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；HH-2 型恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司；722-P 型分光光度計，上海現科分光儀器有限公司；LDZX-30FBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；MJ106B-Z 型培養箱，上海博訊實業有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 黑松松針的預處理工藝流程

采集松針→清洗→去除兩端末梢→80 ℃烘干→粉碎→松針粉過篩（依次 40 目、80 目、100 目過篩）→脫脂（石油醚）→烘干、備用

1.2.2 黑松松針多糖的提取工藝

稱取預處理好的松針粉1.0 g，以蒸餾水為提取劑，在預試驗的基礎上，在不同的液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH 條件下進行酶解提取試驗，以磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液來調節反應液的酸性環境，酶解結束后沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，將酶解后的提取液進行抽濾，合并濾液進行濃縮處理，加入4 倍體積的95%乙醇，4 ℃條件下靜置12 h，以4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀并冷凍干燥得黑松松針粗多糖。

1.2.3 單因素試驗設計

本試驗對提取出的黑松松針多糖分別選用纖維素酶和果膠酶進行處理，依次考察液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH 對黑松松針多糖得率的影響。

1.2.3.1 液料比對黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預處理好的黑松松針粉，依次按照不同的液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g））混合均勻，纖維素酶和果膠酶的添加量均為2%（設定提取劑體積為100%，下同），用50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同液料比條件下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.2 酶添加量對黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預處理好的黑松松針粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均勻，在不同酶添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）條件下，用 50 ℃水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶添加量時的黑松松針多糖得率。

1.2.3.3 酶解溫度對黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預處理好的黑松松針粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均勻，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量 1.5%，在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）條件下水浴酶解2 h，沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶解溫度下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.4 酶解時間黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預處理好的黑松松針粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均勻，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量1.5%，于50 ℃條件下分別水浴酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，沸水浴 10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同酶解時間下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.3.5 pH 對黑松松針多糖得率的影響

精密稱取1.0 g 預處理好的黑松松針粉，按照液料比 20∶1（mL/g）混合均勻后，在不同 pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）下，纖維素酶添加量 2.5%，果膠酶添加量在1.5%，50 ℃水浴酶解（纖維素酶酶解2 h，果膠酶酶解1.5 h），沸水浴10 min 滅酶終止酶解反應，調節pH 至7.0，提取黑松松針多糖，分別考察纖維素酶和果膠酶在不同pH 條件下提取的黑松松針多糖得率。

1.2.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，分別選取纖維素酶、果膠酶，按照液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解時間5個因素，設計五因素四水平的正交試驗L16（45），以確定最優提取條件。試驗因素水平見表1 和表2。

表1 纖維素酶提取松針多糖的正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by cellulase

表2 果膠酶提取松針多糖反應的正交試驗因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal test for extraction of pine needle polysaccharides by pectinase

1.2.5 復合酶法提取黑松松針多糖

根據纖維素酶和果膠酶的正交試驗結果，采用復合酶法（纖維素酶、果膠酶）來提取黑松松針多糖，同時研究兩種加酶方法對黑松松針多糖得率的影響。一種為同步加酶法，即將纖維素酶和果膠酶按照各自最適濃度一次性同時加入；另一種采用分步加酶法，即兩種酶分別在各自的最適條件下按照先a 后b（a→b）和先 b 后 a（b→a）的順序加入進行提取（a 為纖維素酶、b 為果膠酶），探究不同加酶方法對黑松松針多糖得率的影響。

1.2.6 黑松松針多糖得率測定

采用苯酚-硫酸比色法[6]測定。制備葡萄糖標準曲線，以標準溶液濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，并進行回歸處理，得到回歸方程：y=7.768 7x+0.049 8，R2=0.999 3。結果表明，葡萄糖溶液在0～4.0 mg 范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

1.2.7 黑松松針抑菌性能研究

采用紙片擴散法[7]，考察黑松松針多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的體外抑菌效果，以無菌生理鹽水為空白對照，37 ℃條件下培養48 h 后觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.8 數據處理

所有試驗均重復測定3 次，結果取平均值。采用Origin Pro 8.0 軟件進行數據制圖，數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對黑松松針多糖得率的影響

由圖1 可見，隨著液料比的增加，纖維素酶、果膠酶提取黑松松針多糖的得率逐漸增加。這是因為液料比的適當增加，促進提取液內物質的流動，有利于多糖的溶解，進而提高多糖得率。采用纖維素酶和果膠酶單一酶提取黑松松針多糖的最佳液料比均為20∶1（mL/g），其中使用纖維素酶提取的多糖得率稍高。但當液料比繼續增加，酶濃度逐漸降低，導致酶與底物結合不充分，最終使多糖得率降低。這與周思杰等[3]、范文奇等[8]的研究結果相似。

圖1 液料比對黑松松針多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.2 酶添加量對黑松松針多糖得率的影響

由圖2 可見，隨著酶添加量的增加，松針多糖得率均呈現先增加后減少的趨勢。纖維素酶添加量為2.5%時，黑松松針多糖得率最高；果膠酶添加量為1.5%時，黑松松針多糖得率最高。推測原因是隨著酶添加量的增加，酶與底物接觸機會增多，使得多糖提取率呈現上升趨勢，但當酶添加量繼續增加時，底物濃度逐漸降低，酶對溶出的多糖也開始起作用，最終導致多糖得率下降。

圖2 酶添加量對黑松松針多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.3 酶解溫度對黑松松針多糖得率的影響

由圖3 可見，隨著酶解溫度的升高，黑松松針多糖得率也不斷提高，使用纖維素酶和果膠酶單一酶提取的松針多糖均在酶解溫度50 ℃時其得率達到最高，其中酶解溫度對纖維素酶影響較大。這是因為隨著溫度的升高，分子熱運動增強，多糖溶解速度加快，但是當溫度繼續上升時，多糖得率不斷降低，推測是高溫使得酶蛋白變性，酶活力減弱，直至完全喪失，多糖得率隨之下降。這與蔣德旗等[9]的研究結果相近。

圖3 酶解溫度對黑松松針多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.4 酶解時間對黑松松針多糖得率的影響

由圖4 可見，隨著酶解時間的延長，使用纖維素酶提取的多糖得率受酶解時間的影響較大，酶解2 h時，松針多糖得率最高，推測原因，隨著酶解時間的延長，底物組織結構充分破壞，多糖得以釋放出來；使用果膠酶提取的松針多糖在酶解1.5 h 時，酶與底物進行充分反應，松針多糖得率較好，隨著酶解時間的延長，果膠酶活性下降，部分多糖已破壞，使得多糖得率逐漸降低。這與吳龍月等[10]的研究結果相似。

圖4 酶解時間對黑松松針多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.1.5 pH 對黑松松針多糖得率的影響

pH 也是影響酶活性的重要因素之一。如圖5 所示，使用纖維素酶和果膠酶提取的松針多糖均在pH為6.5 時得率最高，這是因為pH 的升高或降低直接影響酶活性。此外，極酸或者極堿環境會造成多糖中糖苷鍵的斷裂，使得多糖結構遭到破壞[11]。

圖5 pH 對黑松松針多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis pH on polysaccharides yield from Pinus thunbergii needles

2.2 正交試驗結果

2.2.1 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗結果

采用直觀分析法進行數據處理，探究各個因素對松針多糖得率的影響程度，結果如表3 所示。液料比的極差最大，為1.305，表明液料比在黑松松針多糖提取過程中對多糖得率的影響最大，且最佳液料比為20∶1（mL/g）。各因素對黑松松針多糖得率的影響程度依次為：A＞C＞D＞E＞B，纖維素酶提取黑松松針多糖最優條件為 A2B3C2D2E3，即液料比 20∶1（mL/g），纖維素酶添加量2.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，pH 6.5。通過對最佳工藝條件進行驗證試驗得到黑松松針多糖得率為4.73%，高出正交試驗組的最佳組合。根據纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗方差分析結果（表4）可知，液料比對黑松松針多糖得率影響顯著（P＜0.05）。

表3 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗的結果Table 3 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

表4 纖維素酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by cellulase

2.2.2 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗結果

果膠酶提取黑松松針多糖正交試驗結果如表5所示。各因素對黑松松針多糖得率的影響程度依次為：C’＞E’＞B’＞D’＞A’，果膠酶提取黑松松針多糖最優條件為即液料比 20∶1（mL/g），果膠酶添加量1.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h，pH 6.5。通過對最佳組合進行驗證試驗得出黑松松針多糖得率為3.62%。根據果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗方差分析結果（表6）可知，酶解溫度和pH 是松針多糖提取的顯著影響因素（P＜0.05）。

表5 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗的結果Table 5 Results of orthogonal test on polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

表6 果膠酶提取黑松松針多糖工藝正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction from Pinus thunbergii needles by pectinase

2.3 復合酶法提取黑松松針多糖得率結果

根據上述正交試驗結果，同步加酶法是將纖維素酶（酶添加量2.5%）和果膠酶（酶添加量1.5%）按照液料比 20∶1（mL/g），酶解溫度 50 ℃，纖維素酶酶解時間2 h、果膠酶酶解時間1.5 h，pH 6.5 條件下提取黑松松針多糖。分步加酶法，即兩種酶分別在各自的最適條件（正交的最優條件）下按照先纖維素酶后果膠酶和先果膠酶后纖維素酶的順序分別加入進行提取。結果如表7 所示。

表7 不同加酶法提取的松針多糖得率Table 7 Results of polysaccharides yied from Pinus thunbergii needles with different enzymatic methods 單位：%

由表7 可見，分步加酶法提取黑松松針多糖的效果優于同步加酶法，與王艷等[12]的研究結果相似，這是由于分步加酶法是在各自酶的最佳反應條件下進行的酶解反應，使得兩種酶的酶解效率得到提高，且先加纖維素酶后加果膠酶的順序提取松針多糖的效果較好，松針多糖得率最高，為6.17%。植物細胞的細胞壁主要由纖維素、果膠等組成，多糖通常包裹在植物細胞壁內，推測先加纖維素酶可以水解松針細胞壁的纖維素，破壞細胞壁結構，促進多糖成分溶出，后加果膠酶對細胞壁進一步進行降解，利于多糖的溶出，還可以降低提取液的黏度。

2.4 抑菌試驗結果

由圖6 可見，經過纖維素酶和果膠酶酶解提取的黑松松針多糖溶液對大腸桿菌（抑菌圈直徑為11.25 mm）和枯草芽孢桿菌（抑菌圈直徑為12.78 mm）有較好的抑菌效果。

圖6 黑松松針多糖的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effects of polysaccharide from Pinus thunbergii needles

3 結論

黑松松針的細胞壁構成主要是纖維素、半纖維素、果膠質等，本試驗選用纖維素酶和果膠酶，可以更加有效地破壞松針細胞結構，提高多糖成分的提取率。本試驗先采用單酶的單因素試驗和正交試驗，確定單酶提取多糖的最優條件并進行驗證試驗，再采用復合酶法進行提取研究，證實分步加酶法提取的多糖得率較高。工藝參數為：液料比 20∶1（mL/g），酶解溫度50 ℃，pH 6.5，先添加2.5%纖維素酶，酶解時間2 h，后添加果膠酶1.5%，酶解時間1.5 h，該條件下提取的松針多糖得率最高，為6.17%。通過松針多糖的抑菌試驗證實該方法提取的黑松松針多糖溶液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用。本試驗設計的復合酶分步加酶法提取黑松松針多糖提高了多糖得率，并且提取的多糖具有一定的抑菌效果，為植物性生物活性物質的提取和黑松松針多糖的開發利用了提供依據。