基于生物信息學方法的祛風解表中藥干預過敏體質機制研究*

張昆林 ，孫鵬程 ，陳雪梅 ，陳建新 ，張妍 ，王一 ，王濟 ，王琦

（1.中國科學院心理健康重點實驗室，中國科學院心理研究所，北京 100101；2.中國科學院大學心理學系，北京 100049；3.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；4.北京中醫藥大學國家中醫體質與治未病研究院，北京 100029）

過敏性疾病又稱變態反應性疾病，在過去幾十年中發病率顯著上升，世界變態反應組織（WAO）2004年在全球33個國家（未含中國、印度等）的流行病學調查結果[1]顯示：在這些國家的12億總人口中，22%患有特異性免疫球蛋白E（IgE）介導的過敏性疾病，如過敏性鼻炎、哮喘、結膜炎、濕疹等，影響兒童和成人的生活質量，嚴重全身過敏反應甚至危及生命。WAO在2013年發布的《WAO White Book on Allergy》[2]中指出，在發達國家和發展中國家，全世界變態反應性疾病的流行率都在急劇上升，應將過敏作為一大公共衛生問題，并在非傳染性疾病的框架內加以解決。

目前西醫學主要使用脫敏及對癥治療的方法控制過敏，常用藥物包括減充血劑、皮質激素類、肥大細胞穩定劑、抗膽堿藥、抗組胺藥以及白三烯受體拮抗劑等，這些藥物作用效果快，但作用位點單一，常見不良反應有頭暈、嗜睡、口干惡心等，且長期使用容易產生耐藥性等弊端[3-4]。對于頻發、多發的過敏性疾病，現有研究多從病、證、病機的角度闡發中醫藥治療策略。王琦院士提出“辨體-辨病-辨證相結合”的診療模式，構建過敏體質理論，指出過敏體質是機體易發過敏性疾病的根本原因，防治過敏性疾病的核心在于調節“體質土壤”[5-6]。近年來西方學者的研究印證了過敏體質的存在。Goks觟r等[7]指出，過敏的進程包括過敏性疾病相關模式的共存，而不僅僅是單一過敏性疾病的逐步發展。Ferreira等[8]的研究表明，濕疹、花粉癥和哮喘有共同的遺傳風險基因。因此過敏體質是過敏進程的內在原因，須改變治療“過敏病”的觀念，確立治療“過敏人”的思想，以干預過敏體質來防治過敏性疾病，是中醫藥從根本上解決過敏的好方法[5]。

從實驗研究的角度，中藥的抗過敏作用已得到廣泛驗證。研究表明天然藥物中包含的多種黃酮類化合物、萜類化合物、醌類化合物等有良好的抗過敏活性[4]。目前臨床使用較多的為祛風解表等藥物，歸肺經的解表藥居于首位[9]。研究發現祛風中藥能在抑制IgE產生、保護和穩定靶細胞膜、對抗過敏介質、中和變應原等多個環節起作用[10]。因此本研究以“祛風解表”作為研究視角，將體質與藥物相結合，運用網絡藥理學、多組學聯合通路分析等方法構建藥物-靶點-通路網絡，以期揭示中藥調控過敏體質的分子機制。

1 材料與方法

1.1 解表祛風中藥提取藥物靶點 在中國知網（CNKI）以“抗過敏中藥”為關鍵詞檢索，篩選有實驗研究支撐的單味中藥。通過TCMSP數據庫[11]，以口服生物利用度OB≥20%，類藥性（DL）≥0.10為標準篩選活性成分。使用PharmMapper數據庫[12]進行靶點預測。以Norm.Fit>0.8&zscore>0.5為閾值篩選靶點，使用UniProt數據庫[13]將篩選后的靶點轉化為Entrez ID 及 Gene Symbol。

1.2 GWAS catalog提取過敏易感基因 下載GWAS catalog數據（版本號：e100_r2020-12-02），從中提取與3種典型過敏性疾病（哮喘、過敏性鼻炎、濕疹）都相關的易感基因（P<5e-8）[14]。并加入Ferreira等[8]通過GWAS結果預測的這3種過敏性疾病的功能性基因。

1.3 過敏體質表達芯片數據提取差異基因 基于已有數據，從過敏體質基因芯片表達數據[15]中提取差異基因。該數據來自5個過敏體質（過敏性鼻炎）病例和5個健康對照。取外周血分離樹突細胞，體外培養誘導成熟，對兩組成熟前后的樹突細胞分別用 Agilent Human lncRNA（4*180K）芯片檢測，總計20個樣本數據。鑒別出成熟前（imDEG）、成熟后（mDEG）兩組差異基因。差異基因為表達差異>1.5倍及線性模型P值<0.05的基因。

1.4 多組學聯合通路分析 使用KOBAS 3.0[16]對以上4個基因集（靶蛋白/GWAS易感基因/imDEG/mDEG）分別做通路富集分析，采用超幾何分布檢驗，通路數據庫取KEGG、REACTOM、BioCyc、PANTHER、GO，共檢測6 268個通路。使用Python 2.7進行多組學聯合分析，參照PaintOmics[17]多組學聯合通路分析的思想對每一個通路的4個統計檢驗結果進行P值合并（元分析）。因為數據涉及同一組學數據內部平權和不同組學數據之間的平權，所以采用Stouffer’s Z-score方法[18-19]進行P值合并，基于該方法對P值進行整合的元分析方法已經收錄于常用統計遺傳學工具并被廣泛使用[20–23]。取靶蛋白、GWAS基因、imDEG、mDEG通路的權重分別為1/3、1/3、1/6、1/6。最后用 Bonferroni校正法（P 值乘以檢驗次數）對元分析的P值進行校正。取在4個基因集中均包含2個及以上基因、總基因數不超過200[24]且校正P值<0.05的通路作為多組學顯著性通路。

1.5 核心靶點篩選及藥物-靶點-通路網絡構建 將過敏相關多組學顯著通路涉及的藥物靶點導入 STRING（Version：11.0）[25]數據庫，建立蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）。導入 Cytoscape 3.8.0[26]，使用cytoHubba插件[27]計算 MCC（Maximal Clique Centrality，最大集團中心度）算法得分。將結果與Mcode插件[28]篩選的子網絡（默認參數）相印證，確定核心靶點（hub gene）。

2 結果

2.1 藥物活性成分及靶點篩選結果 篩選到15味有抗過敏作用的解表祛風藥，發散風寒藥包括麻黃、桂枝、紫蘇葉、生姜、荊芥、防風、白芷、細辛、蒼耳子、辛夷、鵝不食草，發散風熱藥包括薄荷、蟬蛻、桑葉、葛根。共篩選出545個活性成分，預測獲得1 602個靶點，按閾值篩選后，剔除未匹配到UniProt ID的結果并去重后獲得225個靶點。轉化為Entrez ID及Gene Symbol后共計226個基因。

2.2 GWAS catalog提取基因結果 從GWAS catalog數據中提取到易感基因356個。加入Ferreira等[8]預測的132個功能基因，合并去重后得到427個基因。

2.3 過敏體質表達芯片數據提取基因結果 樹突狀細胞成熟前后的病例組和健康組分別鑒定出1 240個（imDEG）和743個（mDEG）差異基因。

2.4 多組學通路分析結果 靶蛋白/GWAS基因/imDEG/mDEG的單組學通路分析分別得到3 860、3 406、2 688、1 563 個通路，合并去重后共 6 268 個通路，交集為582個通路。在4個基因集中均包含兩個及以上基因、總基因數不超過200且校正P值Pstouffer_bon<0.05的多組學顯著性通路共有24個。結合文獻，確定6個過敏相關顯著性通路，對應藥物的28個靶點蛋白。通路為：白細胞介素（IL）-4和IL-13信號（R-HSA-6785807）、T細胞受體信號通路（GO：0050852）、CD28家族的共刺激（R-HSA-388841）、脂多糖的細胞反應（GO：0071222）、轉化生長因子（TGF）-β 受體信號通路（GO：0007179）、抗原加工-交叉提呈（R-HSA-1236975）。見表1。

表1 過敏相關顯著通路Tab.1 Allergy-related significant pathways

2.5 中藥核心靶點篩選及網絡構建結果 28個靶點蛋白中確定11個核心靶點。見表2。

表2 抗過敏藥物核心靶點Tab.2 The core targets associated with anti-allergy drugs

將15味藥物、28個靶點、6條通路的數據導入Cytoscape，構建藥物-靶點-通路網絡。見圖1。

圖1 藥物-靶點-通路關系圖Fig.1 Drug-target-pathway interaction

3 討論

3.1 過敏相關顯著性通路分析 過敏反應中，首次接觸具有過敏原的個體黏膜部位后，便建立了敏化階段。通過駐留在各個黏膜組織中的樹突狀細胞攝取和呈遞過敏原，可以激活幼稚的CD4+T細胞并分化為2型輔助T細胞（Th2）[29]。交叉提呈是免疫系統監測組織和吞噬細胞是否存在異物抗原的主要機制。抗原提呈細胞，如樹突狀細胞，是賦予交叉提呈抗原能力的主要細胞[30]。在1型過敏反應下，樹突狀細胞的提呈導致Th2細胞驅動的針對過敏原的特異性免疫應答[29]。

主要組織相溶性復合體（MHC）分子對關聯抗原肽的特異性識別會觸發T細胞受體（TCR）信號轉導，T細胞上的共刺激受體和共抑制受體確定T細胞功能并決定TCR信號轉導的功能結果[31]。TCR激活可促進許多信號轉導級聯反應，許多TCR信號通路的破壞可能導致Th2表型，進而驅動機體過敏性疾病[32]。

T淋巴細胞的激活被認為至少需要兩個信號，一個信號由抗原識別后T細胞受體復合物傳遞，另一個由共刺激受體（如CD28）參與時提供[33]。共刺激信號通路主要影響T細胞的活化、增殖和分化，并導致Thl/Th2分化比例失衡，在過敏性疾病的發病過程中起著重要作用[34]。

IL-4和IL-13是由Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞產生的2種細胞因子，它們與哮喘和過敏密切相關。由IL-4和IL-13驅動的Th2細胞及其細胞因子的產生促進了B細胞過敏原IgE抗體的產生[29]。IL-4和IL-13還能激活JAK/STAT信號級聯反應，對過敏反應有促進作用[35]。

TGF-β是生長因子超家族中具有免疫負調控功能的一大類細胞因子家族，在調節炎癥反應、傷口愈合、免疫穩態及免疫耐受中發揮重要作用[36]。過敏性疾病發展的關鍵機制涉及對調節性T（Treg）細胞介導的免疫耐受的干擾，Turner等[37]最新的一項研究證明了Treg細胞來源的TGF-β1在調節變態反應和自身免疫反應中的關鍵作用。

脂多糖（LPS）作為革蘭陽性菌細胞壁成分，在人類工作或生活環境中幾乎無處不在，是一種強烈的免疫調節物質，能促進Th1型反應而抑制Th2型反應，與過敏性哮喘呈負相關。同時有研究表明LPS具有對Th1/Th2平衡有雙向調節作用[38]。

3.2 祛風解表藥物核心靶點分析 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8）、MAPK1、MAPK14 均是 MAPK 家族的成員。MAPK是生物體內重要的信號轉導系統之一，能被多種炎性刺激所激活，并對炎癥的發生、發展起重要調控作用[39]。在T細胞中，MAPK8和MAPK9是Th細胞分化為Th1細胞所必需的。動物實驗發現MAPK8基因敲除小鼠緩解了特應性皮炎樣癥狀[40]。MAPK1/ERK2和 MAPK3/ERK1是在MAPK/ERK級聯中起重要作用的2個MAPK。ERK1/2與包括Th2分化和增殖在內的過敏性炎癥有關。氣道中ERK1/2 MAPK的磷酸化引起炎癥和結構變化，從而導致T細胞活化、嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤、支氣管高反應性和氣道重塑[41]。MAPK14/p38α調節多個T細胞受體相關信號，并對Th2分化和過敏性炎癥產生負面影響[42]。

基質金屬蛋白酶（MMP）是由Ca2+激活的、依賴Zn2+的內肽酶家族，具有降解細胞外基質（ECM）和基底膜各種成分的能力。它們與正常的生理組織重塑、炎癥和腫瘤擴散有關。MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP9與腸黏膜炎癥相關[43]。MMP-3和MMP-9與哮喘的慢性氣道改變有關，可以通過釋放和激活潛在的基質結合生長因子來增強氣道纖維化和平滑肌增殖[44]。

蛋白激酶B（AKT1）是稱為AKT激酶的3種緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1，AKT2和AKT3）之一。AKT1參與哮喘氣道平滑肌的重塑。質粒轉導或慢病毒感染引起的AKT1過表達會導致培養的犬氣道心肌細胞的大小和蛋白質含量逐漸增加，表明AKT1的激活可能導致哮喘的氣道平滑肌肥大。AKT1可能是預防或逆轉哮喘氣道平滑肌肥大的有用治療靶標[45]。

PDPK1通過磷酸化作用調節一組相關的蛋白激酶的活性，包括 PKB/Akt、S6K、RSK、SGK 以及 PKC等。其中PKC是過敏原及腫瘤壞死因子（TNF）-α等促炎因子的重要靶標，PKC活化后可引起促炎信號的累積，如NF-κB的激活，中藥成分如牛蒡子苷元等可以通過抑制PDPK1阻斷MAPK通路的信號轉導，抑制NF-κB基因的表達[46]。PDK1可以減輕豚鼠氣管分離肌的收縮，作為哮喘靶標可能有益于氣流阻塞[47]。PDK1可能作為嗜酸性粒細胞炎癥的新型治療靶標[48]。

Src家族激酶是非受體蛋白酪氨酸激酶。Src激酶與哮喘發病機制中涉及的細胞活化有關，參與肥大細胞、嗜酸性粒細胞和其他細胞的激活。Src在TCR刺激后的信號通路激活和轉導中起重要作用，在T細胞發育、分化、增殖和存活中至關重要[49]。Lck是Src家族成員。鑒于Lck在細胞因子產生和T細胞信號轉導中起主要作用，Lck表達和活性的改變可能導致各種疾病，例如哮喘、牛皮癬、炎癥性腸病等，可以確立為各種炎癥介導的病理生理條件下的治療靶標之一[50]。

Hsp90是真核生物中特征明確，保守且必不可少的伴侶蛋白。Hsp90α是Hsp90的亞型，Hsp90α除具有細胞內作用外，目前還被認為在傷口愈合和炎癥中起分泌性細胞外作用[51]。由于其結合與解離與炎癥因子信號通路中許多信號分子的非活性/活性結構密切相關，可以作為炎癥信號通路的研究靶分子[52]。

JAK3是非受體酪氨酸激酶JAK家族成員，在細胞的生長、存活、發育、分化、增殖、凋亡及免疫調節等方面起重要作用。JAK3對樹突狀細胞的成熟和耐受性起著至關重要的作用[53]。在特應性皮炎中，JAK1、JAK2和JAK3明顯過表達。JAK/STAT途徑在多種炎癥性皮膚病中具有重要作用，JAK3被認為炎癥性皮膚病的潛在靶點[54]。

PARP是真核細胞內具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基（PAR）催化活性的蛋白酶，與炎癥、腫瘤、衰老等疾病相關聯。在樹突細胞內，PARP1破壞樹突細胞免疫活性[55]。PARP與人的哮喘和過敏性鼻炎有遺傳相關性，抑制PARP可能成為抗過敏性哮喘的未來治療策略[56]。

4 結論

本研究從過敏體質入手，綜合運用多種生物信息學分析方法，首次在通路水平將來自3個不同數據源（中藥的預測靶點、GWAS提取的過敏共病基因、基因芯片鑒定的過敏體質差異基因）的基因結果集進行相互印證，結合基因組學和轉錄組學數據信息，綜合檢測過敏過程中靶蛋白可能參與的通路。通過元分析合并P值并加權校正，篩選出6條多組學顯著性通路。這些通路主要反映了樹突狀細胞的提呈、T細胞受體信號轉導、Th2型細胞因子分泌以及免疫耐受的過敏進程。通過將這6條通路涉及的28個靶點建立蛋白互作網絡，建立藥物-靶點-通路網絡，篩選出11個核心靶點，它們基本是免疫、炎癥、過敏的相關重要分子，是祛風解表中藥調控過敏體質的可能關鍵節點。

本研究突破了中藥調控單一過敏性疾病的研究模式，將“祛風解表”的臨床治法和“體質土壤”的疾病機制相關聯，鑒定了祛風解表中藥干預過敏體質的關鍵通路和關鍵靶點，有助于中醫藥治療過敏機制研究的方法學革新，推進疾病醫學向體質醫學的發展與轉化，以期發揮中醫藥特色與優勢應對全球過敏危機。同時研究也存在藥物和基因集數據量偏少、缺少實驗驗證等不足，期待后續研究中進行完善。