迷迭香酸干預PI3K/Akt信號通路保護缺氧/復氧損傷血腦屏障功能的影響*

陳鵬，瞿晶田，王婧斯

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2.盈科瑞（天津）創新醫藥研究有限公司，天津 300385）

血腦屏障（BBB）是腦毛細血管阻止某些物質由血液進入腦組織的結構[1]。神經元在正常活動時，需要非常穩定的內環境，而這種穩定性的實現，有賴于BBB的存在。研究顯示，腦缺血再灌注損傷時，BBB不僅有結構的損傷和改變，也出現功能異常，即通透性改變、轉運功能破壞等[2]。同時，BBB功能性開放又導致外周有害物質的滲入，引起繼發性腦損傷[3]。腦微血管內皮細胞（BMEC）是構成血腦屏障的主要結構[4]，BMEC一面與血液接觸，一面與腦細胞連接，保護神經元免受血液中潛在有害物質的損害，其細胞間的緊密連接是BBB模型的一個重要特征[5]。目前BMEC體外培養模型已經被廣泛應用于BBB的研究。

迷迭香酸（RA）是一種水溶性的天然酚酸類化合物，廣泛存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中，具有較強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[6]。目前，對RA在腦缺血后的保護作用報道較少，尤其在RA維持腦缺血后BBB功能方面尚未見報道。因此，本研究體外原代培養大鼠BMEC，以氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）損傷，模擬在體腦缺血再灌注損傷的BBB模型。通過檢測細胞活力、乳酸脫氫（LDH）漏出、跨細胞間電阻（TEER）值，異硫氰酸熒光素（FITC）-葡聚糖透過，羅丹明 123（Rh123）蓄積等指標，明確RA對OGD/R損傷BMEC的保護作用；通過檢測緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5和轉運蛋白P-gp、MRP1 mRNA表達，證實RA可以維持腦缺血后BBB的功能；通過p-Akt/Akt蛋白表達及抑制劑的應用，初步考察RA對BBB功能影響的可能的上游機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 迷迭香酸（RA，質量分數＞98%），上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS），北京索萊寶科技有限公司；Ⅱ型膠原酶、膠原酶/分散酶、內皮細胞生長因子（ECGF），Roche公司；CCK-8試劑盒，同仁化學；LDH試劑盒，Promega公司；異硫氰酸熒光素（FITC）-葡聚糖，Sigma公司；PrimeScript TMRT 試劑盒、SYBR誖Premix Ex TaqTM，TaKaRa 公司；p-Akt、Akt抗體，CST 公司；β-actin、ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1 引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；LY294002抑制劑，Calbiochem公司。

1.2 動物 Wistar大鼠，20日齡，體質量（40±5）g，雌雄不限，共計購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 儀器 低溫離心機，美國Beckman公司，酶標儀，美國，MD公司，PCR擴增儀，美國，Bio-rad公司，實時熒光定量系統，美國，Bio-rad公司，凝膠成像系統，美國，Bio-rad公司。

2 方法

2.1 腦微血管內皮細胞培養 參考文獻[4]，將Wistar大鼠脫頸處死，置于75%乙醇中浸泡3～5 min消毒。取出全腦，置于冷的D-Hank’s液中，去除小腦、間腦、血管、軟腦膜等，保留大腦皮質。用眼科剪將腦組織剪成約1mm3碎片，加入0.7mg/mL Ⅱ型膠原酶，37℃消化 1h，1000×g離心 10min，棄上清液，加 20%BSA混勻，1 000×g離心20 min，保留底層沉淀。再加入 1 mg/mL 膠原酶/分散酶，37 ℃消化 1 h，700×g離心6min，棄上清液，DMEM液漂洗2次，加入DMEM全培基（含 20%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、30 μg/mL ECGF、100 μg/mL肝素鈉）重懸細胞，接種于 75 cm2培養瓶中，2 d后換液，單層BMEC融合至70%～80%時傳代。用消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA組成）消化，輕輕吹打成細胞懸液，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入DMEM全培基重懸，種于培養板中。

2.2 分組及處理 將傳代的BMEC密度調至4×105/mL，根據實驗需要分別種于96孔板、6孔板及Transwell套筒上，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每2 d換液1次。待細胞融合時分為5組：對照組（Con），加入全培基，正常孵育 24 h；模型組（OGD/R），加入平衡鹽溶液，置于95% N2-5% CO2條件下缺氧培養6 h后，置換為全培基，正常孵育18 h；RA組，分別加入終濃度 2.5、5、10 μmol/L RA 的平衡鹽溶液，置于95%N2-5% CO2條件下缺氧培養6 h后，置換含 2.5、5、10 μmol/L RA 的全培基，正常孵育18 h。抑制劑組，提前給予20 μmol/L LY294002孵育1 h后，處理方法同其他組。

2.3 CCK-8試劑盒檢測細胞活力 細胞分組處理后，棄上清液，培養板中每孔加入100 μL含10% CCK-8的DMEM培養液，37℃孵育30 min，酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度（A）。

2.4 LDH試劑盒檢測乳酸脫氫酶漏出量 細胞分組處理后，吸取25 μL的上清液于96孔板中，加入25 μL CytoTox-ONETMReagent，于 22 ℃孵育 10 min后，加入 12.5 μL Stop Buffer，振蕩 10 s，于激發波長560 nm，發射波長590 nm處檢測熒光值。

2.5 跨細胞間電阻的測量 BMEC種于套筒內側，每天固定時間測定細胞間電阻值，即將電阻儀電極分別插入Transwell小室內外側，待電阻值達到穩定后可用于實驗。細胞分組給藥處理后，再測量每組TEER值。

2.6 FITC-葡聚糖通過量的測定 細胞處理24 h后，用D-Hanks洗2遍，Transwell套筒內側加入1 mg/mL FITC-葡聚糖，外側加入1.5 mL平衡鹽溶液，孵育4 h后，Transwell套筒內外側分別取液體100 μL，加入到96孔板，酶標儀檢測，激發波長為494 nm，發射波長為520 nm，計算FITC-葡聚糖透過量。

2.7 Rh123攝取實驗 細胞分組處理后，棄上清液，每孔加入含有終濃度為5 μmol/L的Rh123，37℃避光孵育120 min，用冷HEPES溶液終止轉運并漂洗細胞3遍后，加入0.2% Triton吹打細胞，細胞裂解后吸取上清液于激發波長485 nm，發射波長530 nm處檢測熒光強度。并按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白質含量。

2.8 緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5和耐藥蛋白P-gp、MRP1 mRNA檢測 BMEC接種于6孔培養板中，培養至80%融合，分組加藥處理。各組用Trizol提取細胞總RNA，按Two-Step RT-PCR試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。檢測ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1 mRNA表達水平，以β-actin為內參，各基因進行相對定量分析。

2.9 Westernblot法檢測p-Akt、Akt蛋白表達 BMEC分組加藥處理后，棄掉上清液，用預冷D-Hanks洗2遍，加入RIPA裂解液，超聲裂解細胞，混懸液低溫離心15 min，吸取上清液，蛋白定量、變性。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后，轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗p-Akt、Akt，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 5 min×3 次，加入辣根過氧化酶標記的二抗免疫球蛋白G（IgG），室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，增強化學發光法顯影。采用ImageJ軟件分析，記錄灰度值，進行定量分析。

2.10 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 RA對OGD/R損傷BMEC細胞活力及LDH漏出量的影響 與Con組相比，OGD/R組BMEC細胞活力明顯下降（P<0.001），LDH漏出量明顯升高（P<0.001），RA 在 2.5、5、10 μmol/L 時能顯著升高缺氧損傷 BMEC細胞活力（P<0.05，P<0.001，P<0.001），降低LDH漏出量（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。見表1。

表1 RA對OGD/R損傷BMEC細胞活力及LDH漏出量的影響（±s）Tab.1 Effect of RA on viability and LDH leakage of BMEC cells injured by OGD/R（±s）

表1 RA對OGD/R損傷BMEC細胞活力及LDH漏出量的影響（±s）Tab.1 Effect of RA on viability and LDH leakage of BMEC cells injured by OGD/R（±s）

注：與 Con組比較，###P<0.001；與 OGD/R 組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

組別Con組OGD/R組RA-L組RA-M組RA-H組動物數 6 6 6 6 6劑量（μmol/L） 細胞活力（%） LDH漏出率（%）- 99.70±1.03 101.12±1.87- 56.52±5.68### 210.05±20.02###2.5 63.33±3.98* 181.21±25.92*5 75.31±4.27*** 166.16±14.00**10 86.20±5.04*** 152.31±17.41***

3.2 RA對OGD/R損傷BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透過、Rh123攝取的影響 跨細胞間電阻值是最簡單、直觀的體現BBB完整性的方法。本研究所培養BMEC細胞在種于套筒內側7 d后TEER值可達到170～180 Ω/cm2，證明細胞屏障生成，可用于后續實驗。OGD/R處理后，TEER值明顯降低（P<0.001），而給予5、10 μmol/L RA后可抵消ODG/R損傷造成的 TEER 降低（P<0.01，P<0.001）。見表 2。

FITC-葡聚糖透過、Rh123攝取實驗，是檢測BBB屏障功能的常用指標。BMEC在經過OGD/R處理后，FITC-葡聚糖通過率、胞內Rh123蓄積量明顯增加（P<0.001，P<0.001），而給予 5、10 μmol/L RA 處理后能降低FITC-葡聚糖透過率（P<0.05，P<0.001），給予10 μmol/L RA能降低胞內Rh123蓄積量（P<0.01），提示RA不僅能維持內皮細胞間的緊密連接，而且能維護內皮細胞的轉運功能。見表2。

表2 RA對OGD/R損傷BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透過、Rh123 攝取的影響（±s）Tab.2 Effect of RA on TEER，FITC-dextran penetration and Rh123 uptake of BMEC injured by OGD/R（±s）

表2 RA對OGD/R損傷BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透過、Rh123 攝取的影響（±s）Tab.2 Effect of RA on TEER，FITC-dextran penetration and Rh123 uptake of BMEC injured by OGD/R（±s）

注：與 Con組比較，###P<0.001；與 OGD/R 組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

組別動物數劑量（μmol/L）透過率（%）TEER值（Ω/cm2）Con組OGD/R組RA-L組RA-M組RA-H組6 6 6 6 6 Rh123（%）- 178.32±4.88 100.01±1.41 100.88±7.89- 144.23±6.52### 170.98±13.53### 175.11±16.32###2.5 147.38±7.34 155.61±12.82 171.97±18.67 5 159.28±7.47** 149.22±11.65* 153.30±20.11 10 165.66±7.59***133.37±17.59***140.06±12.04**

3.3 RA 對 OGD/R 損傷 BMEC ZO-1、Claudin-5、P-gp和MRP1mRNA表達的影響 緊密連接是BBB通透性的中心環節，ZO-1、Claudin-5是緊密連接的主要結構蛋白，其表達水平的變化與BMEC通透性的改變程度密切相關。本實驗通過Real time RTPCR法檢測OGD/R損傷BMEC緊密連接ZO-1、Claudin-5 mRNA表達，結果顯示，OGD/R損傷后，與Con組比較，OGD/R組 BMEC中 ZO-1、Claudin-5 mRNA 表達顯著降低（P<0.001，P<0.001）；與 OGD/R組比較，5、10μmol/L RA 能顯著增加 ZO-1（P<0.01，P<0.001）、Claudin-5 （P<0.001，P<0.001）mRNA 表達。見圖1。

圖1 RA對OGD/R損傷BMEC ZO-1、Claudin-5 mRNA表達的影響（n=6）Fig.1 Effect of RA on mRNA expression of ZO-1 and claudin-5 of BMEC injured by OGD/R（n=6）

BBB的主要功能是阻止外源和有害物質進入腦內，BBB上存在多種轉運蛋白，參與物質的吸收和外排。本實驗進一步檢測RA對轉運蛋白P-gp、MRP1 mRNA表達的影響。結果顯示，OGD/R損傷后BMEC轉運蛋白P-gp、MRP1 mRNA表達顯著降低，而給予5、10 μmol/L RA干預可以顯著增加P-gp（P<0.05，P<0.001）、MRP1（P<0.05，P<0.01）mRNA 表達。見圖2。

圖2 RA對OGD/R損傷BMEC P-gp、MRP1 mRNA表達的影響（n=6）Fig.2 Effect of RA on mRNA expression of P-gp and MRP1 of BMEC injured by OGD/R（n=6）

3.4 RA對OGD/R損傷BMEC p-Akt蛋白表達的影響 血腦屏障的生物化學和構象改變可受多條信號通路調節，本研究從與中樞神經系統損傷保護機制密切相關的PI3K/Akt信號通路，考察RA對BBB的調節作用。與Con組相比，OGD/R組BMEC細胞的p-Akt蛋白表達明顯降低（P<0.001），給予 5、10 μmol/L RA后能不同程度的升高p-Akt表達（P<0.001，P<0.001），提示RA可能通過Akt信號通路發揮BBB的保護作用。見圖3。

圖3 RA對OGD/R損傷BMEC p-Ak蛋白表達的影響（n=3）Fig.3 Effect of RA on p-Ak protein expression of BMEC injured by OGD/R（n=3）

3.5RA通過PI3K/Akt通路調節OGD/R損傷BMEC BBB功能 與Con組相比，OGD/R組BMEC細胞TEER 值降低（P<0.001），FITC 透過率、胞內Rh123量增加（P<0.001，P<0.001）；與OGD/R組相比，10μmol/L RA能夠顯著升高TEER值（P<0.01），降低FITC透過率、胞內Rh123量（P<0.01，P<0.05）；提前給予PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002可以明顯拮抗RA對BBB的上述保護作用（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。見圖4。

圖4 RA通過PI3K/Akt通路調節OGD/R損傷BMEC BBB 功能（n=3）Fig.4 RA regulates BMEC BBB function induced by OGD/R through PI3K/Akt pathway（n=3）

4 討論

BBB結構和功能的損害，使BBB通透性增加，影響腦缺血的病理生理過程，兩者之間密切相關。腦缺血損傷后，快速保護并維持BBB功能，是預防繼發性神經元損傷的關鍵[5-6]。RA廣泛分布于多種植物中，尤以唇型科和紫草科植物中含量最高，具有較強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[7-9]。目前，對RA的神經保護作用多關注于神經退行性疾病的治療[10-11]，對腦缺血后神經系統的作用，尤其是對BBB的影響尚未見報道。查閱文獻不難發現，丹參水溶性成分可以維持腦缺血后BBB穩定性，增強緊密連接蛋白表達[12]。因此，推測RA作為丹參中重要的水溶性成分，可能對BBB具有一定保護作用，其可能是丹參水溶性成分發揮BBB保護作用的物質基礎之一。本研究利用原代培養大鼠BMEC細胞，建立體外BBB模型，考察RA對缺血缺氧損傷BBB功能的保護作用及機制。結果發現，RA可以顯著逆轉OGD/R誘導的BMEC TEER值降低，FITC-葡聚糖透過率增加，胞內Rh123蓄積，證實RA對BBB功能具有保護作用。

BBB的功能指通過其特有的緊密連接結構和多種藥物外排轉運體表達，以達到限制外周物質進入腦內，保持腦內環境穩態的作用[13]。跨膜蛋白，胞質附著蛋白及細胞骨架蛋白共同組成緊密連接，各種信號通路通過調控這些蛋白達到對BBB的調節[14]。ZO-1蛋白是胞質附著蛋白，將跨膜蛋白和細胞骨架蛋白連接在一起，并能識別緊密連接位置及傳遞各種信號，是緊密連接支持結構的基礎，ZO-1缺失會導致緊密連接結構的破壞[15]。Claudins是組成緊密連接的跨膜蛋白，其種類的組成直接決定BBB的功能[16]。研究表明，在腦缺血后，BBB通透性的改變與其緊密連接蛋白Claudin-5密切關聯[17]。腦缺血損傷后，腦毛細血管內皮細胞不僅緊密連接蛋白被破壞，同時轉運蛋白亦受影響。轉運蛋白能識別特定分子，使糖類、氨基酸類等營養物質順利通過到達腦內，同時阻止外源和有害物質進入腦內，以維持神經系統內環境的相對穩定[18-19]。P-gp和MRP1是腦毛細血管內皮細胞膜上重要的轉運蛋白，P-gp主要存在于腦毛細血管內皮的管腔側，可將其底物從腦中外排到血液中，從而限制了這些物質向腦內的轉運[20]。MRP家族主要介導多種有機陰離子的外排轉運，如氧化谷胱甘肽等。研究發現，小鼠經大腦中動脈閉塞（MCAO）處理[21]，或體外內皮細胞經OGD處理后[22]，腦內皮細胞P-gp、MRP1轉錄水平均呈下調狀態。且MRP1缺陷小鼠表現出更大的腦卒中病變，提示轉錄蛋白是預防中風的保護因子，具有神經保護作用[23]。本研究在評價RA對BBB通透性及轉運能力的基礎上，對緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5和轉運蛋白P-gp、MRP1的mRNA表達進行考察，進一步證實RA可以影響BBB緊密連接蛋白及轉運蛋白的表達。韋立群發現，RA衍生物能有效下調MCF-7/ADM細胞中多藥耐藥基因的表達水平，從而降低MCF-7/ADM的耐藥性誘導其凋亡[24]。這似乎與本研究結果相反，究其原因是由于實驗目的并不相同，這也正體現中藥對不同疾病的廣泛應用。

PI3K/Akt通路是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）始動的生物信號轉導通路，近來發現與中樞神經系統損傷的保護機制密切相關。研究顯示，腦缺血損傷后，誘導激活PI3K/Akt信號通路，可對神經凋亡產生抑制作用，促進干細胞增殖，發揮神經保護作用[25-26]。外源性藥物通過PI3K/Akt信號通路可減輕腦損傷大鼠的神經炎癥和BBB破壞，改善神經功能缺損[27]。本研究結果發現，OGD/R損傷后，BMEC細胞Akt表達水平明顯降低，給予RA后可以顯著升高Akt表達。提前給予抑制劑LY29004，可以明顯拮抗RA對BMEC細胞的通透性及轉運功能，進一步證實了RA發揮BBB保護作用與PI3K/Akt信號通路相關。

基于以上結果提示，RA對缺氧/復氧誘導的體外BBB功能具有保護作用，可以影響腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白、轉運蛋白表達，其機制可能與促進PI3K/Akt信號激活有關。這一結果為RA在神經保護方面的進一步研究提供了實驗基礎。