芍藥苷固體脂質納米粒凝膠劑的制備與體外透皮研究

徐麗清，劉丹，唐文娟

（1.大連市第三人民醫院藥劑部，大連 116033；2.上海市楊浦區中心醫院藥學部，上海 200090）

芍藥苷（Paeoniflorin）是從毛茛科植物芍藥、牡丹、紫牡丹等芍藥屬植物的干燥根中提取的一種糖苷類單體化合物，具有抗炎、止痛、降糖、保肝、免疫調節等多種藥理學作用[1]，目前臨床上主要用于治療類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、乙型肝炎、肥胖癥等疾病[2-3]。近年來研究發現，芍藥苷對炎癥性皮膚病（如：扁平苔鮮、干燥綜合征、接觸性皮炎）和自身免疫性皮膚病（銀屑病、紅斑狼瘡）等具有良好的治療效果[4]，目前已將其制備成凝膠劑[5]用于皮膚病的治療。然而，芍藥苷屬于水溶性、脂溶性均較差的藥物（LogP值為-0.42，正辛醇/水），不利于藥物透皮吸收，影響到藥物的治療效果[6]，因此需要通過合適的藥物載體以提高芍藥苷的皮膚透過性，有效發揮藥物療效。固體脂質納米粒（SLNs）是以固態脂質作為基質，將藥物包裹在其內核或吸附在其表面，構成的新型藥物載體系統，可提藥物的滲透性，延長作用時間，在藥物透皮系統中具有廣闊的應用前景[7-9]。另外，可將固體脂質納米粒進一步分散在凝膠系統中，形成澄清透明、均一穩定凝膠網狀結構，可以增加藥物與皮膚黏附性和涂展性，便于藥物使用[10]。因此，本研究針對芍藥苷的脂溶性差、不利于透皮吸收的缺點，將其制備成固體脂質納米粒凝膠系統，以增加芍藥苷的透皮性能、改善藥物的治療效盯，為芍藥苷的皮膚疾病治療提供一種新的給藥途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LYD500W-T-24G型高速分散均質機（上海嵐譽智能化科技有限公司）；iChrom 5100高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；LVEM5型臺式透射電子顯微鏡（QUANTUM量子科學儀器貿易北京有限公司）；Malvern Zetasizer 1600 Nano ZS型激光粒度測定儀（英國Malvern公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；超濾管（截留分子量：100 000道爾頓，密理博中國有限公司）。

1.2 試藥 芍藥苷原料藥（上海贏瑞生物醫藥科技有限公司，含量：99.4%，批號：L730213）；山崳酸甘油酯（Compritol 888 ATO），雙硬脂酸甘油酯（Precirol ATO 5），單硬脂酸甘油酯（GLycerol Monostearate），三肉豆蔻酸甘油酯（Dynasan 114）均由嘉法獅上海貿易有限公司惠贈；大豆磷脂（上海太偉藥業股份有限公司）。

SD 大鼠，雄性，SPF 級，體質量（250±20）g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）310101045。

2 方法與結果

2.1 固體脂質種類篩選 分別選擇Compritol 888 ATO（山崳酸甘油酯，熔點：70～72℃），Precirol ATO 5（雙硬脂酸甘油酯，熔點：56℃），Dynasan 114（三肉豆蔻酸甘油酯，熔點：61～65℃），GLycerol Monostearate（單硬脂酸甘油酯，熔點：78～81℃）作為固體脂質納米粒的脂質相，通過測定芍藥苷在固體脂質相與水形成的體系中分配系數（D）來篩選固體脂質。依次取400 mg上述固體脂質分別與20 mL純化水混合，水浴溫度加熱至固體脂質熔融，稱取10 mg芍藥苷分散在熔融混合液中，磁力攪拌30 min；將混合物冷卻并離心（10 000 r/min，10 min），測定芍藥苷在水相中的含量（Qw）。根據公式計算分配系數：D=（10-Qw）/Qw；同時評估芍藥苷在上述固體脂質中的溶解度，取10 mg芍藥苷和400 mg固體脂質，在高于脂質熔點溫度10℃保溫15 min，冷卻放置24 h，在光學顯微鏡下觀察。結果顯示，芍藥苷在Compritol 888 ATO，Precirol ATO 5，Dynasan 114 和 GLycerol Monostearate和水體系中的分配系數（D）分別為：（4.2±0.3）、（11.7±0.4）、（2.2±0.3）、（2.9±0.6）。芍藥苷與 Compritol 888 ATO，Dynasan 114和 GLycerol Monostearate形成的混合物中均能夠觀察到藥物晶體，而與Precirol ATO 5形成的混合物中未觀察到有藥物晶體析出。基于芍藥苷在固體脂質中的分配系數以及在固體脂質中的溶解性，選擇Precirol ATO 5作為固體脂質納米粒的脂質載體。

2.2 芍藥苷固體脂質納米粒的制備 本研究以Precirol ATO 5作為固體脂質，以大豆磷脂作為表面活性劑，采用熱熔乳化輔助均質法[11]制備芍藥苷固體脂質納米粒。制備工藝如下：稱取處方量的Precirol ATO 5和大豆磷脂加入到5 mL乙醇中，超聲溶解，再按照處方比例稱取處方量芍藥苷加入到上述脂質溶液中，攪拌至藥物完全溶解，水浴加熱至60℃保溫；另稱量取50 mL純化水，水浴加熱至60℃保溫；在高速（3 000 r/min）磁力攪拌，將含藥有機相快速加入到純化水中，分散形成白色乳狀液，保持60℃水浴溫度，持續高速攪拌30 min，揮干乙醇，補加同溫度純化水至總體積50 mL；在將該溶液放入到高速分散均質機中均質處理，均質速度為20 000 r/min，均質10 min，均質過程樣品始終保持（60±2）℃水浴溫度。均質結束后將乳液迅速放入到冰水浴中，即得到芍藥苷固體脂質納米粒，放置到4℃冰箱中保存，備用。

2.3 粒徑測定 使用Malvern Zetasizer 1600 Nano ZS型激光粒度測定儀測定芍藥苷固體脂質納米粒粒徑分布（nm）。移取0.2 mL樣品溶液加入到石英比色杯中，輕輕搖勻，放入到激光粒度測定儀中檢測，設置檢測參數為：檢測溫度為25℃，檢測波長為633 nm，入射角為90°。每個樣品平行測定3次，取平均值。

2.4 包封率測定 本研究作者采用超濾離心法測定芍藥苷固體脂質納米粒的包封率。選擇截留分子量為100 000道爾頓超濾離心管，精密移取1 mL芍藥苷固體脂質納米粒樣品置超濾離心管上腔中，固定到離心管上，放入到臺式離心機中離心，轉速為 4 000 r/min，離心半徑 10 cm，離心20 min，收集離心管中的超濾液，全部轉移至10 mL量瓶中，加入流動相定容，搖勻，過濾，取續濾液經高效液相色譜法（HPLC）測定藥物含量，得到游離藥物質量（W游離）；另取該批次芍藥苷固體脂質納米粒1 mL加入到100 mL量瓶中，加入少量甲醇破壞，再加入流動相定容，搖勻，過濾，取續濾液經HPLC測定藥物含量，得到總藥物質量（W總）；參照文獻，本研究選擇測定芍藥苷含量的色譜條件[5]如下：色譜柱為Dikma Diamasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為230nm，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86），流速為1.0 mL/min。按照下列公式計算芍藥苷固體脂質納米粒的包封率：EE（%）=（1-W游離/W總）×100%。每個樣品平行測定3次，包封率取平均值。

2.5 處方優化

2.5.1 Box-Behnken實驗設計優化處方 根據預實驗考察結果并參考文獻[12-13]資料，篩選出對芍藥苷固體脂質納米粒的粒徑分布和包封率影響較顯著的處方變量作為考察對象，即以脂藥比（X1）、固體脂質濃度（X2）及表面活性劑濃度（X3）作為自變量，以平均粒徑（Y1）和包封率（Y2）為評價指標，采用 3因素3水平的Box-Behnken設計優化芍藥苷固體脂質納米粒處方。設計包括重復實驗的中心點和一系列多維實驗點，實驗設計因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計中的變量水平Tab.1 Variable level in Box-Behnken experimental design

2.5.2 方差統計分析 應用“Design Expcrt 10.0”統計軟件對表2中的實驗數據進行方差分析，結果見表3。粒徑分布（Y1）和藥物包封率（Y2）的兩個模型方程的P值分別為0.000 3和0.000 7，差異均有統計學意義（P<0.01）；失擬項P值分別為0.066 7和0.331 0，模型預測值與實際值之間差異不存在顯著，模型擬合具有足夠高的可信度。Y1、Y2多元二次方程分別為：

表2 實驗設計中的自變量（X）和因變量（Y）Tab.2 Independent variables(X)and dependent variables(Y)in Box-Behnken experiment design

表3 擬合方程中各項系數及方差分析結果Tab.3 Fitting equation coefficients and ANOVA results

通過3D響應面圖可直觀解釋自變量與因變量之間的關系，響應面的彎曲程度反映了自變量對因變量的變化敏感性。曲面彎曲程度大，說明自變量對因變量的變化敏感性較大，反之則說明自變量對因變量的變化敏感性較小。脂藥比、固體脂質濃度及表面活性劑濃度對芍藥苷固體脂質納米粒的粒徑分布的曲面彎曲程度影響較大，即隨著脂藥比和固體脂質濃度的增加，粒徑增大，隨著表面活性劑濃度的增加，粒徑減小，這是由于固體脂質濃度的增加或是表面活性劑濃度減小，沒有足夠的多的表面活性劑包裹在納米粒周圍，因此得到的固體脂質納米粒粒徑較大。見圖1。脂藥比、固體脂質濃度及表面活性劑濃度對芍藥苷固體脂質納米粒的包封率的曲面彎曲程度影響較大，包封率隨著脂藥比和固體脂質濃度的增加而增大，隨著表面活性劑濃度的增加出現先增大后減小趨勢。見圖2。

圖1 脂藥比（X1）、固體脂質濃度（X2）及表面活性劑濃度（X3）對芍藥苷固體脂質納米粒的粒徑分布（Y1）的響應面圖Fig.1 Response surface diagram of lipid-drug ratio(X1)，solid lipid concentration(X2)and surfactant concentration(X3)to average particle size(Y1)of paeoniflorin solid lipid nanoparticle

圖2 脂藥比（X1）、固體脂質濃度（X2）及表面活性劑濃度（X3）對芍藥苷固體脂質納米粒的包封率（Y2）的響應面圖Fig.2 Response surface diagram of lipid-drug ratio(X1)，solid lipid concentration(X2)and surfactant concentration(X3)to encapsulation efficiency(Y2)of paeoniflorin solid lipid nanoparticle

2.5.3 最佳處方預測與驗證 本研究要求制備的芍藥苷固體脂質納米粒粒徑分布達到“最小值”，包封率達到“最大值”[14]，通過軟件擬合得到芍藥苷固體脂質納米粒的最佳處方為脂藥比為80∶1、固體脂質濃度為12.0mg/mL，表面活性劑濃度為10.0mg/mL，軟件預測納米粒的粒徑分布為171.4 nm，包封率為92.2%。通過制備3批芍藥苷固體脂質納米粒驗證最佳處方的可靠性，結果顯示粒徑分布平均值為（179.3±10.9）nm，包封率為（91.1±0.9）%，實測值與預測值接近，最佳處方的可信度較高。

2.6 芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的制備 本研究以卡波姆940作為凝膠基質制備芍藥苷固體脂質納米粒凝膠。稱取0.5 g卡波姆940加入到50 mL純化水中，持續攪拌直至分散均勻；另取50 mL芍藥苷固體脂質納米粒溶液加入到卡波姆940溶液中，攪拌混合均勻；在持續攪拌下加入三乙胺至pH值6.5左右[15]，形成凝膠溶液，即得到芍藥苷固體脂質納米粒凝膠，冰箱中保存備用。

參照文獻[16]沖和凝膠制備工藝如下：稱取50 mL蒸餾水，稱取6 g甘油（保濕劑）和87.5 mg亞硫酸氫鈉（穩定劑）加入到蒸餾水中攪拌溶解，再稱取0.75 g卡波姆940分散到溶液中分散均勻，用三乙胺調節pH值至6.5，形成凝膠狀溶液，最后加入0.568 g芍藥苷和0.170 g蛇床子，攪拌分散均勻，既得到沖和凝膠，冰箱中保存備用。

2.7 微觀形態觀察 取芍藥苷固體脂質納米粒，加入少量蒸餾水稀釋，并滴加到300目的銅網格上均勻鋪展，用濾紙在邊緣吸干水分，自然干燥，再滴加一滴5%（W/V）磷鎢酸溶液，負染10 min，揮干水分；另取芍藥苷固體脂質納米粒凝膠加入蒸餾水稀釋，按照上述方法操作制備樣品，將樣品放置在透射電子顯微鏡下觀察固體脂質納米粒的微觀形態。通過透射電鏡照片可知，芍藥苷固體脂質納米粒在制備成凝膠前后粒徑大小幾乎未發生變化，粒徑大約在200 nm左右，均為球狀或類球狀，表面光滑圓整，也未觀察到有藥物晶體析出。

圖3 芍藥苷固體脂質納米粒及其凝膠透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy of paeoniflorin solid lipid nanoparticle and their gels

2.8 體外透皮滲透實驗 本研究采用Franz擴散池法評估芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的體外透皮滲透性[17-18]。取雄性SD大鼠，實驗前禁食不禁水1夜，用電推剪剪下大鼠腹部毛發，再脫毛劑徹底去除，將大鼠處死并剪下腹部皮膚，用鑷子去除皮下脂肪和肌肉組織，經生理鹽水清洗干凈，將鼠皮夾在Franz擴散池中間，角質層面向供給池，真皮層面向接收池。透皮面積約為3.14 cm2，接收池中加入20%（V/V）PEG 400的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）8.45 mL作為接收液以滿足漏槽條件，將接收池放入到（32±0.5）℃維持恒定溫度，同時接收池中放入一枚攪拌磁子，轉速為200 r/min。

分別取1.0g沖和凝膠（芍藥苷含量均為10mg/g）和1.25 g芍藥苷固體脂質納米粒凝膠（芍藥苷含量均為8 mg/g）加入到供給池中進行透皮實驗。分別在 1、2、3、4、6、8、10、12 h 時間點從接收池中取出0.5 mL接收液（并補加同溫同體積空白接收液），離心，取上清液適當稀釋，經HPLC法測定各時間點的藥物含量（Ci），并根據公式1-1計算各時間點的單位面積累積透皮量（Qi，μg/cm2），并以 Qi對 t進行線性回歸，根據公式1-2計算藥物的穩態滲透速率（Js，μg/h/cm2）。

式中：V0為接收液體積，A為皮膚透皮面積（3.14cm2），Cd為供給池中藥物濃度，Ci為第i（i≤n-1）個取樣點藥物濃度。

實驗結束后取下鼠皮，用生理鹽水洗凈，剪碎鼠皮，加入1.0 mL生理鹽水研磨成漿狀液，轉移至10 mL容量瓶中，加入少量乙腈超聲20 min，定容，取適量溶液離心，取上清液，經HPLC法測定藥物含量，計算兩種凝膠劑在皮膚中的滯留量。

沖和凝膠和芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的透皮動力學參數見表4。結果顯示，與沖和凝膠相比芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的透皮吸收顯著性提高（P<0.05），芍藥苷固體脂質納米粒凝膠組的Q12和Js分別是沖和凝膠組的3.1倍和3.4倍，表明芍藥苷固體脂質納米粒凝膠能夠顯著提高藥物的透皮性能；另外，芍藥苷固體脂質納米粒凝膠組的藥物在皮膚中的滯留量是沖和凝膠組的4.8倍，表明芍藥苷固體脂質納米粒凝膠可以黏附性在皮膚表面，起到藥物貯庫作用，提高藥物在皮膚中的滯留量，延長藥物作用時間。

表4 沖和凝膠和芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的透皮動力學方程及透皮參數Tab.4 Transdermal dynamic equation and transdermal parameters of Chonghe gel and paeoniflorin solid lipid nanoparticle gel

圖4 沖和凝膠和芍藥苷固體脂質納米粒凝膠經皮Qi-t關系圖Fig.4 Percutaneous Qi-t relationship between Chonghe Gel and paeoniflorin solid lipid nanoparticle gel

3 討論

本研究將芍藥苷制備成固體脂質納米粒，并通過Box-Behnken設計優化得到最佳處方組成為：芍藥苷與固體脂質質量比為80∶1，固體脂質Precirol A的濃度為12.0 mg/mL，表面活性劑大豆磷脂的濃度為10.0 mg/mL，制備得到芍藥苷固體脂質納米粒的粒徑為（179.3±10.9）nm，包封率為（91.1±0.9）%，表面光滑圓整，無聚集，分散性良好。體外透皮實驗結果顯示，芍藥苷固體脂質納米粒凝膠的單位面積累積透皮量（Q12）和穩態滲透速率（Js）分別是沖和凝膠的3.1倍和3.4倍，且在皮膚中的滯留量是沖和凝膠的4.8倍，一方面是由于卡波姆作為凝膠基質黏附到皮膚上，可減少皮膚表面水分蒸發，增加角質層水合作用，改變角質層的結構，有利于藥物滲透；另一方面是由于藥物被包裹在脂溶性脂質載體中，增加了藥物的親脂性，同時由于表面活性劑大豆磷脂的存在，可以與皮膚之間相互作用，改變角質層的緊密結合，基于這兩方面的綜合作用導致芍藥苷在皮膚中的滲透性及滯留量增加，有望提高芍藥苷對皮膚病的治療效果。