光感受器移植在視網膜退行性疾病中的應用研究進展

余 超，李秋玉，邵 毅

0引言

光感受器丟失是視網膜變性疾病的主要原因之一，由于哺乳動物的視網膜沒有再生能力，因此視網膜變性疾病將導致視桿和視錐細胞光感受器的永久性丟失，而完全失明。據世界衛生組織估計，全世界視網膜變性疾病的人數約為2.85億[1]；而據估計在歐盟范圍內，年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)或遺傳性視網膜變性(inherited retinal degeneration, IRD)等疾病中有3 400萬人的視網膜變性與光感受器丟失相關[2]。龐大的患者數目給世界經濟帶來巨大負擔。目前通過光感受器移植進行治療，而光感受器的獲取和植入后的免疫排斥影響是影響其療效重要因素。

1光感受器的解剖與功能

感光細胞是視網膜光敏細胞，為大腦提供視覺輸入。感光細胞是眼中最大的神經元細胞群，約占視網膜的80%。感光細胞位于神經視網膜的最外層，其細胞體形成所謂的外核層(outer nuclear layer, ONL)。人體視網膜包含一種類型的視桿(低強度光照條件下提供視覺)，三種類型的視錐，可以實現三色日光和高敏銳度的感知。光感受器外節以膜片(桿狀)或褶皺(圓錐形)的形式包含大量的細胞膜伸展，可容納大量跨膜的光色素。色素由蛋白質(視蛋白)和發色團(視網膜)組成。接受光信號之后膜盤內的11-順式視黃醛異構化為全反式視黃醛。隨后，觸發次級信使級聯反應，使環狀核苷酸門控離子通道關閉，并最終使感光體超極化。然后，超極化信號通過連接的纖毛被動傳輸到內部部分，隨后到含核的細胞體，最后是軸突末端。軸突末端含有一個專門的帶狀突觸，可調節突觸的釋放。超極化信號降低了Ca2 +水平，使神經遞質谷氨酸，以進補、分級的方式突觸間隙的釋放減少。帶狀突觸與水平和雙極細胞的突觸后末端一起形成獨特的突觸三聯體。當棒僅與ON雙極接觸時，圓錐形感光體與ON或OFF雙極突觸，其特征分別是抑制性谷氨酸受體和興奮性谷氨酸受體的分布不同。在信號以各種并行處理通道的形式通過視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGC)傳輸到大腦之前，視覺信號處理的第一級是在內部核層(inner nuclear layer, INL)進行的(除Müller膠質細胞外)，還包含雙極，水平和無長突細胞[3]。

其他兩種細胞類型對于正常的感光器功能至關重要，它們不通過神經元信號傳遞，而是通過視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)和Müller膠質細胞的維持和支持功能。感光體OS與底層RPE形成密切聯系。RPE除了在視網膜和脈絡膜之間形成邊界[因此是血-視網膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的一部分]外，在光吸收、離子、流體和代謝物的上皮運輸以及生長因子分泌上有重要功能[4]。重要的是RPE每天吞噬大約外段長度的1/10，從而使全反式類維生素A循環成11-順式形式。因此，RPE作為視覺周期的一部分，為感光器的維護和功能提供了必要的支持。除了它們在基底和根尖與繼發神經元和RPE細胞的連接外，感光器還被Müller膠質細胞突包裹。 Müller膠質細胞形成內部和外部限制膜，覆蓋神經核的大部分層和叢狀層，密封大部分神經視網膜[除了OS和IS(inner segment)的一部分]。 此外它還具有適當的感光器功能，包括結構穩定，谷氨酸和發色團的吸收和再循環以及離子和水的動態平衡感知[5]。光感受器代表了視覺感知的中心單元，將光轉換為生物信號以通過化學突觸傳遞，并依賴于與RPE和Müller膠質細胞的緊密接觸。

2視網膜退行性疾病治療現狀

鑒于全球視力障礙和失明的形勢嚴峻，新型治療策略的研究活動激增，但對于大多數致盲疾病，并沒有真正的治愈方法[6]。

引入抗體阻斷血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，可以大大減少濕性ARMD患者的新生血管形成，延遲光受體破壞速度，改善和保持視覺功能。但長期研究SEVEN-UP的結果顯示，開始治療后7～8a，有一半以上的患者視力下降，視力下降程度取決于疾病最初幾年VEGP抑制劑的注射規律[7]。另外，這種策略對高達25%的患者無效。

FDA于2017-12批準LCA基因補充方法后第一種眼基因療法進入市場。這種方法通過使用AAV載體，將催化全反式向11- 順式視網膜的異構化的正常RPE65基因導入患者RPE細胞，注射到視網膜下間隙，使視覺功能得到改善(在兒童中效果最好)[8]。盡管尚存在許多缺陷，RPE65基因補充的成功激勵了研究者對影響RPE，視桿或視錐光感受器的一系列其他視網膜疾病開發基因療法。通過這種基因療法優化修復RPE和光感受器，恢復視力，為視網膜疾病的治療帶來希望。

3光感受器獲取與移植

3.1概述根據目前多項臨床試驗結果，通過多能干細胞衍生的RPE細胞治療ARMD和Stargardt疾病安全而且穩定[9],為光感受器的移植安全提供了事實依據。在大多數移植研究中，供體細胞是年輕的后光受體或視網膜片，從小鼠/人類視網膜(原發細胞)獲得或從小鼠/人類PSC中提取。視網膜片可以直接移植到宿主亞視網膜空間，如若是細胞懸浮液，需要進行光受體濃縮[通過 FACS(fluorescence activated cell sorting) 或基于 MACS(magnetic-activated cell sorting) 的排序來實現]。移植后，應用組織學技術(光學相干斷層掃描、免疫組織化學、電子顯微鏡)分析宿主細胞的定位和宿主視網膜內的相互作用。供體細胞的功能和突觸連接可以使用相應技術在不同級別進行測試，從單細胞記錄、微電極陣列(評估視網膜內視網膜細胞水平的功能)到通過行為測試(如水迷宮或淺暗盒)向更高的視覺中心發出信號[10]。

3.2獲取與任何細胞治療方法一樣，識別合適的細胞類型和來源對光感受器移植的成功極為重要。臨床前實驗大多使用原代細胞或組織進行移植，然而與使用有絲分裂后感光器相比，這種策略并不是很成功。

2006年開始，在視網膜變性疾病的細胞治療方法中，首選的且最常用的原代細胞類型是年輕的，解離的有絲分裂后光感受器的豐富群體，也稱為光感受器前體。胚胎階段11.5d到成年的視網膜發育階段獲得移植細胞懸液之后，出生的第4～7d是桿狀感光受體前體分離和移植的最佳階段[11]。關于視錐細胞感光細胞，相應的發育階段大約在E15.5左右，初步研究表明，有絲分裂后的幼小視錐細胞適合用于移植，因為這些細胞的存活率比成年感光細胞高[12]，并能在視網膜下間隙有效成熟[13]。

然而將幼小的供體感光細胞在人體中培養到適宜階段會帶來一系列倫理法律等問題，為此近年來通過胚胎多能干細胞或誘導性多能干細胞(embryonic stem cell/induced pluripotent stem cells, ESC / iPSC)獲得可移植感光體，并結合胚狀體(EB)形成和2D培養系統。但最初只能成功地獲得培養物中ESC衍生的神經祖細胞。為了進一步分化為感光細胞，這些神經祖細胞必須移植到成年大鼠的視網膜下間隙中[14]或將其與胚胎產后第1d或成年胚胎共培養[15]。隨后誘導多能干細胞(iPSC)被證明也具有向感光細胞分化的能力。以上培養基本通過使用細胞外基質來操縱發育信號通路的方法產生光感受器，但是整體效率非常低，只有不到20%的細胞表達出光感受器特異性標記。

mESC衍生的視網膜類器官含有桿狀光感受器，可以對其進行MACS富集，并移植到野生型和晚期視網膜變性小鼠受體中存活并表達成熟的光感受細胞。作為一種新興技術，類器官領域仍然有大量工作需要完成，如標準化和有效協議的進一步完善，這有助于生產符合GMP條件的用于臨床的光感受器移植物。另外，針對相關的培養時間長問題，可以采用培養機器人和生物反應器標準化工作步驟擴大移植生產規模來解決(已在腦類器官的產生和視網膜組織體的制備中應用)。盡管初始步驟尚未實現標準化或自動化，仍然需要具有專業技術技能的專家研究人員，但這無疑是減少因時間帶來的成本的解決方法之一。

3.3純化分離感光體的最初策略包括成年視網膜的連續酶解、機械解離，以及通過顯微鏡評估確定獲得相對純凈感光體種群的最佳解離時間。現階段利用GFP的熒光報告蛋白標記和分離可移植細胞。在感光器領域，進一步的研究利用不同小鼠模型特定的視網膜細胞表達GFP報告蛋白，作為在宿主視網膜內的鑒定工具，并在移植前對其進行分離和富集[16]，具體可以利用FACS進行。

但由于高壓和剪切力，FACS對細胞產生相當大的壓力。另外有研究表明，感光細胞的存活力隨分離時間的增加而降低，而FACS是一個相對較慢的過程(每個細胞都被單獨詢問和分類)，增加細胞的死亡率，并不適合用于臨床應用。而利用磁激活細胞分選(MACS)作為替代，通過MACS，基于磁性可以同時分類數百萬甚至數十億個磁性標記的細胞，且相對溫和，幾乎沒有負面影響。在使用CD73作為細胞表面標志物的情況下，證明基于MACS的分選產生了高度富集的桿狀光感受器群體并具有來自原代小鼠視網膜的高細胞活力[17]以及mESC衍生的視網膜類器官。MACS技術具有巨大的可擴展性潛力，很容易適應GMP條件和自動化處理，是一種運用于臨床應用的細胞分選系統。

3.4移植較其他器官的移植，光感受器移植到視網膜具有以下優勢：(1)親和性更好，不需要高侵入性手術方法；(2)眼睛是免疫特權器官，免疫排斥較其他器官弱。光感受器移植的目標位置是所謂的視網膜下空間，即退化的視網膜和RPE的剩余光感受器(如果有的話)之間的空間。正常情況下，感光器外部片段與RPE細胞緊密接觸，這是類維生素A視覺周期和感光器外部片段尖端的每日吞噬作用所必需的。在移植過程中，使感光器外部與RPE之間視網膜脫離產生空間進行移植。視網膜與RPE的重新附著通常在幾天之內發生。移植方法包括單細胞移植、視網膜片移植以及生物材料支持移植。

單細胞移植優勢在于:(1)能移植準確數量的細胞； (2)供體和宿主視網膜細胞之間有更好地接觸；(3)外科手術對眼的侵害最少；(4)供體細胞容易標記。獲得的供體光感受器細胞懸液可以經角膜注射,也經玻璃體或鞏膜注射來移植。通過角膜的注射方法中，注射針通過角膜上/下側的移植部位沿對角線進入眼球，而同樣的方法應用于通過玻璃體注射。這種注射方法能夠準確確定注射部位并規避血管損傷。但客觀上視網膜的穿刺仍會導致宿主內發生反應性膠質增生[18]。而盡管經鞏膜注射可避免損壞視網膜本身，但脈絡膜會被擠壓，更容易導致血管損傷，使免疫細胞滲入視網膜并可能形成出血。以上后兩種方法都有細胞逆流的風險，但經玻璃體注射法的優點在于手術過程中可以目視監測注射部位，更易于評估注射過程中的細胞逆流，作出及時的應對。使用單細胞懸浮法，在野生型和晚期視網膜變性的小鼠模型中觀察到適宜的外部節段形成，這表明了移植物在視網膜下空間的成熟受環境因素影響[19]。單細胞懸液移植的缺點包括在推注期間潛在的高細胞死亡率和移植細胞外排，供體細胞移離移植部位錯位，長期細胞存活和整合率低，存在抑制性細胞外基質(extracellular matrix, ECM)蛋白(例如CD44或神經聚糖)等[20]。

視網膜片移植是單細胞懸液的替代方法。該方法是在健康的視網膜內遞送供體感光細胞，并保持其特征性分層組織。在大鼠模型中，視網膜片(視網膜上，視網膜下或脈絡膜)的存活，組織和成熟度與移植物的位置有關[21]。正確放置在SRS(sub-retinal space)中的視網膜片移植物有助于保留視網膜的分層結構，并形成與宿主RPE接觸的外部和內部部分[22]。在臨床模型中，針對晚期色素性視網膜炎患者目前進行的是對移植物存活和視覺恢復的評估。在這種同種異體移植條件且不使用免疫抑制時，視網膜片移植1a內沒有排斥反應。另外在針對10例患有各種視網膜疾病的患者研究中[包括視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和ARMD]，其中7例患者提供了切實的視力改善的臨床證據[23]。Seiler實驗室的最新出版物證明在將hESC來源的視網膜片或胎兒視網膜片移植到大鼠模型后，通過光動力學測試(optokinetic testing，OKT)或上丘和視皮層的電生理記錄顯示的嚴重視網膜變性能恢復視覺功能[24]。視網膜片移植優勢之一是移植物存活率明顯更高[25]。在某些視網膜變性模型中，供體細胞在異常環境中可能損害其生存和分化[26]，但在其他一些模型中，例如Prph2，即使是視網膜變性的后期(即9mo)移植，供體視桿感光細胞也能存活[27]。另外，有可能在視網膜中層壓結構內遞送保持頂基極極性的感光細胞。盡管這研究結果令人歡喜，但視網膜片移植仍然需要解決一系列問題。一個是如何解決除了感光層之外，包含外叢狀、內核乃至內叢狀和神經節細胞層，在注射后形成“雙視網膜”的問題。這種結構影響與宿主二級神經元形成正確的突觸和供體感光細胞產生信號的正確處理(影響程度尚不明確)。另外一個問題是手術方面的，即如何在做到正確定向移植物遞送的同時，控制侵入最小并保障患者的安全。

以上兩種方法的應用于視網膜的變性的不同階段[28]。一般地，視網膜變性的早期階段需要單細胞懸液移植，因為供體細胞可以支持宿主視網膜中剩余的感光細胞。相反，以缺乏宿主感光器為特征的視網膜變性晚期可能需要進行視網膜片移植，盡管視網膜晚期的遞送最佳策略尚存在爭論。

生物材料支持移植：早期試驗將視網膜嵌入明膠基質中，并使用振動切片法將感光體分離。這使供體感光片的操作和移植時受到的損害最小化；同時明膠柔韌無毒害，能在體溫下溶解，使感光體與宿主視網膜融合。最近在生物支架中植入hPSC衍生的光感受器，促進了頂端-基底方向的極化[29]。通常生物支架中具有低楊氏模量(模仿視網膜)的柔性聚合物是最佳的，可以調整內部剛度以匹配其EMC的順應性，柔性聚合物允許在注射過程中進行操作，避免損壞周圍組織[30]。此外，支架的拓撲結構也具有促進細胞黏附(例如通過層黏連蛋白包被進行修飾)的作用。理想情況下，生物支架具有生物相容性、可生物降解性、易于注射性。總之，視網膜細胞和生物支架結合用于供體細胞移植遞送是一種很有潛力的方法。隨著進一步發展，生物材料支架將是一種結合單細胞移植和片狀移植優點的方法。但目前仍然需要進行多項研究以評估生物支架在移植后對視網膜的修復力等。

4光感受器移植的問題與展望

感光體移植的最終目標是通過移植感光體使目前無法治愈的視網膜變性疾病恢復某些視覺功能，從而改善患者的生活。盡管有關感光體移植的大多數研究尚在臨床實驗中，并未實際運用，但隨著科學技術的不斷進步，感光體移植中的相應問題諸如感光體的獲得純化等必將得到解決，感光體移植的不同策略將更好的針對不同視網膜疾病階段進行高效可行的治療，比如目前首個用于治療RPE65 LCA的基因療法已被批準并投放市場，并針對不同情況(包括基于視桿和視錐細胞的疾病)開展了其他幾項基因療法試驗[31]，這無疑是視網膜疾病患者治愈的希望。