視網(wǎng)膜色素變性基因治療的相關研究進展

鄧方圓，韓夢雨，鄧婷婷，金 明

0引言

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組以視桿和視錐感光細胞退化及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞變性為特征的遺傳性視網(wǎng)膜疾病[1]。RP首發(fā)癥狀多為夜盲，隨后是進行性視野喪失及視力下降等。眼底退行性表現(xiàn)通常包括視網(wǎng)膜骨細胞樣色素沉著、視網(wǎng)膜血管變細及視盤蠟黃三聯(lián)征。非綜合征型視網(wǎng)膜色素變性15%～25%為常染色體顯性遺傳RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)，5%～20%為常染色體隱性遺傳RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)，5%～15%為X連鎖遺傳RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)[2]。

RP發(fā)病、病情嚴重程度及進展與基因和遺傳方式有關，受環(huán)境影響。基因治療使用病毒或非病毒載體轉移治療性基因，對視網(wǎng)膜細胞進行遺傳修飾，在基因水平上糾正遺傳缺陷。視網(wǎng)膜為基因治療提供了以下條件：(1)眼內(nèi)結構高度分區(qū)，允許基因傳遞載體集中傳遞，約100μL體積內(nèi)能夠傳遞高達每個載體1.0×1010到2.0×1010個拷貝數(shù)[3]；(2)血-眼屏障避免基因載體眼外擴散，只轉染眼部特定靶細胞，且不易引發(fā)全身副作用；(3)視網(wǎng)膜細胞群體穩(wěn)定，非整合載體導入基因可持續(xù)表達。故而RP基因治療具有獨特優(yōu)勢及切實可行性。

1 RP基因治療載體

基因治療將外源性基因通過基因載體轉染靶細胞，并得以穩(wěn)定復制及表達。RP基因治療載體主要分為病毒載體與非病毒載體。腺病毒(adenovirus，AD)和腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)是RP基因治療研究常用病毒載體[4]。AD轉導有效性高且運載量大。但AD某些血清型流行度高，部分患者攜帶中和性抗體，人體較高免疫原性限制AD基因治療應用。AAV具有廣泛轉染性、較低免疫原性、較高轉導效率及細胞特異性，可有效靶向RPE和視桿、視錐感光細胞，是目前RP基因治療最常用遞送系統(tǒng)。利用基因工程技術修改AAV衣殼，使AAV更適合RP基因治療輸送。Carvalho等[5]在小鼠和靈長類動物視網(wǎng)膜下注射Anc80L65-AAV變體，表現(xiàn)出高水平RPE和光感受器細胞靶向。為了優(yōu)化轉導效率，已分離出幾種AAV衣殼，AAV2/1，AAV2/4和AAV2/6血清型有效轉染RPE細胞[6]。盡管具有較高轉染效率，但病毒載體免疫原性、致瘤性、致突變性不容忽視。非病毒載體可用較大基因片段轉染細胞，且免疫反應風險較低，但缺乏使基因長期表達能力。Gallego等[7]基于微環(huán)DNA技術，有效提高陽離子脂質(zhì)體在體外RPE細胞及大鼠視網(wǎng)膜基因轉染效率。具體可根據(jù)各載體特點，針對致病基因亞型及患者情況酌情選用。

RP基因載體注射途徑主要分為視網(wǎng)膜下注射和玻璃體腔內(nèi)注射。多數(shù)RP基因治療研究采用視網(wǎng)膜下注射載體，通過短暫視網(wǎng)膜脫離注入視網(wǎng)膜下空間以轉染靶細胞。玻璃體腔內(nèi)注射將基因載體注入玻璃體腔，避免視網(wǎng)膜脫離造成視網(wǎng)膜損傷。Davis等[8]證實玻璃體腔內(nèi)注射對視網(wǎng)膜內(nèi)或視神經(jīng)疾病有效。Reid等[9]注射重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體rAAV2/2[7m8]及rAAV2/2[QuadYF+TV]突變嵌合載體rAAV2/2[MAX]于小鼠玻璃體腔內(nèi)，光感受器轉染效率明顯高于單突變血清型。Khabou等[10]改造出玻璃體內(nèi)注射耐受性良好AAV2載體，但對非人類靈長類動物光感受器滲透主要或僅在中心凹。

目前RP基因治療研究多基于動物模型，少數(shù)ARRP(PDE6B、MERTK、RLBP1等)和XLRP(RPGR等)基因型臨床試驗正在進行。ADRP雖尚無相關臨床試驗報道，但ADRP最常見基因型RHO基因治療相關研究較為熱點。現(xiàn)總結RP常見基因型基因治療相關文獻，對RP基因治療療效及安全性研究進展予以綜述。

2視網(wǎng)膜色素變性基因治療

2.1 RHO 視紫紅質(zhì)基因(rhodopsin gene，RHO)編碼參與視覺轉導的光敏蛋白，為ADRP最常見突變基因，約占ADRP的40%[11]。RHO突變型RP患者多于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀，平均每年視敏度(visual acuity，VA)下降1.6%、視野(visual field，VF)喪失2.6%，于50～70歲失明。RHO特征性眼底改變多局限于1～2個象限，且伴發(fā)黃斑囊樣水腫(cystoid macular edema，CME)，少數(shù)患者見廣泛眼底改變。RHO基因P23H突變?yōu)槭讉€確認RP相關基因突變，Mitra等[12]將短干擾RNA(short interfering RNA，shRNA)和野生型RHO與納米顆粒一起輸送到敲入型RhoP23H/P23H小鼠模型中，小鼠視覺功能出現(xiàn)部分改善。然而相關研究結果對比并非十分明顯，或因RHO為活躍基因，在mRNA水平上干擾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平具有挑戰(zhàn)，故而基因組編輯技術成為ADRP基因治療研究熱點。Bakondi等[13]于RhoS334突變小鼠視網(wǎng)膜下注射常間回文重復序列叢集及其相關蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)組件，小鼠視敏度增加53%，光感受器得以挽救。Latella等[14]將CRISPR/Cas9和針對RHO基因外顯子1的3’和5’區(qū)域向導RNA(guide RNA，gRNA)注射表達RHOP23H小鼠模型視網(wǎng)膜下，成功降低突變基因表達水平。Tsai等[15]于小鼠視網(wǎng)膜下注射AAV2/8載體系統(tǒng)傳遞CRISPR/Cas9系統(tǒng)和外源RHO基因，3mo后聯(lián)合消融置換基因治療小鼠外核層(outer nuclera layer，ONL)厚度比單純基因置換治療小鼠ONL厚度增加約17%～36%，且視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)a波和b波振幅更大。Cideciyan等[16]于RHOT4R/+犬視網(wǎng)膜下注射AAV-shRNA820-RHO820，13、17、27、37wk治療區(qū)域ERG振幅a波、b波均較未治療區(qū)域更大，形成顯著對照。CRISPR/Cas9基因編輯可糾正常見RHO突變體(如P23H)，然而RHO基因有150多個突變體，針對所有突變形式的基因敲除與替換相結合或為有效療法。RHO相關RP基因治療于動物模型療效顯著，但ADRP暫無基因治療臨床試驗報道，于RP患者有效性與安全性待確認。

2.2 PDE6B 視桿細胞環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)β亞基由PDE6B基因編碼，可水解cGMP形成5’-GMP，是視桿細胞光信號轉導激活關鍵酶。視桿細胞為主要受累細胞，PDE6B基因突變使感光細胞內(nèi)cGMP增多，cGMP門控陽離子通道持續(xù)開放，陽離子高濃度毒性致使感光細胞壞死。PDE6B突變導致2%～5%的ARRP[2]，PDE6B突變型RP患者較早出現(xiàn)夜盲[17]，多于10歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀，主要病情變化為周邊視野喪失，于高齡(80歲左右)出現(xiàn)CME、后囊下白內(nèi)障(posterior subcapsular cataracts，PSC)及眼底色素沉著。CRISPR/Cas9技術利用單向導RNA(single-guide RNA，sgRNA)指導Cas9于靶基因座處形成DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSB)，斷裂可非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修復(homology-directed repair，HDR)。已被廣泛應用的NHEJ技術基因編輯錯誤率相對高；HDR效率相對低且依賴細胞分裂，但為生殖細胞和增殖細胞基因編輯高保真途徑。Cai等[18]在Cas9介導基因組編輯中添加靶向sgRNA的細菌重組酶A(recombinase A，RecA)蛋白，靶向PDE6B基因座外顯子7，將終止密碼子UAA更改為UAC，發(fā)現(xiàn)Cas9/RecA組小鼠存活視桿細胞數(shù)超過Cas9組5倍，Cas9/RecA組小鼠視錐細胞數(shù)增加超過Cas9組4倍，成功糾正點突變，挽救感光細胞變性，改善小鼠視覺功能，且體內(nèi)外使用Cas9/RecA系統(tǒng)提高HDR效率均有效。但Pichard等[19]發(fā)現(xiàn)PDE6B-RP犬模型視網(wǎng)膜下基因治療只有視網(wǎng)膜發(fā)育早期可實現(xiàn)。PDE6B基因治療概念驗證及安全性研究已在鼠及犬類動物模型完成。目前一項PDE6B基因治療Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗正在進行，尚未發(fā)表研究成果，而已發(fā)表相關基因治療結果對視桿細胞功能和結構評估不足[20]。

2.3 MERTK MER原癌基因酪氨酸激酶(MER proto-oncogene，tyrosine kinase，MERTK)與RPE頂膜感光細胞外段吞噬關鍵受體相關。MERTK基因突變使RPE細胞吞噬能力降低，中斷視覺循環(huán)，使光感受器退化，導致約3%遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(inherited retinal dystrophy，IRD)[21]。MERTK突變型RP患者于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀及視野缺損，10～20歲VA降至20/200及以下，40歲左右失明。眼底病變可見眼球震顫、牛樣眼黃斑病變及黃斑萎縮，未見視盤蒼白相關報道。Ghazi等[22]已經(jīng)成功在皇家外科醫(yī)師學院(Royal College of Surgeons，RCS)視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良模型大鼠視網(wǎng)膜下注射AD和AAV載體補充MERTK，延長大鼠光感受器細胞壽命周數(shù)。Lavail等[23]在RCS大鼠視網(wǎng)膜下注射RPE特異性AAV2載體(AAV2-VMD2-hMERTK)，大鼠ERG反應振幅隨之增加，并于視網(wǎng)膜RPE細胞發(fā)現(xiàn)吞噬小體。Ghazi等[22]通過猴的臨床前研究證實了試驗安全性，并啟動一項Ⅰ期非盲劑量遞增試驗，向6例MERTK相關RP晚期患者視網(wǎng)膜下注射rAAV2-VMD2-hMERTK，術后3例患者視力一過性的改善，無相關副作用及并發(fā)癥，但2例患者視力改善2a后消失。MERTK基因治療概念驗證及安全性研究已在鼠及非人類靈長類動物模型完成，但Ⅰ期臨床試驗結果不甚理想，未來研究或需更關注基因治療疾病及入組患者選擇，并完善結局評價。即使已在動物模型充分驗證，人體臨床試驗細節(jié)仍存在差異。

2.4 RLBP1 視黃醛結合蛋白1(retinaldehyde binding protein 1，RLBP1)基因于RPE和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Müller cell)表達11-順式視黃醛結合蛋白，為視覺周期重要部分。RLBP1突變導致常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性，患病率地域差異大，部分偏遠地區(qū)相對高。RLBP1突變導致感光細胞退化和RPE萎縮，Lima等[24]檢測到無癥狀攜帶者也存在視覺周期缺陷。RLBP1突變型RP患者視野漸進性喪失，最終<5°中心視野殘留，眼底可見白點狀視網(wǎng)膜變性(retinitis punctata albescens，RPA)，少見或不見骨細胞樣色素沉著。Choi等[25]于小鼠視網(wǎng)膜下注射AAV載體同時轉染RPE和Müller細胞，發(fā)現(xiàn)小鼠視桿細胞暗適應速度改善。Maclachlan等[26]于小鼠模型證明在短啟動子CPK850控制下AAV8載體攜帶RLBP1基因治療有效性，但于小鼠、大鼠和非人類靈長類動物的臨床前安全性研究顯示眼內(nèi)炎癥和劑量依賴性視網(wǎng)膜變薄有所發(fā)生。RLBP1基因治療概念驗證及安全性研究已在鼠及非人類靈長類動物模型完成，進行中臨床試驗尚未發(fā)表改善視桿和視錐細胞視覺周期缺陷并穩(wěn)定視網(wǎng)膜變性相關報道。

2.5 RPGR RPGR為視網(wǎng)膜色素變性三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶調(diào)節(jié)基因(GTPase regulator，RPGR)，為最常見引起XLRP基因，約占XLRP的70%～90%。RPGR突變型RP患者較早出現(xiàn)中心視野缺損，年均視野喪失4.7%～9%，多于45歲左右失明。眼底改變見黃斑萎縮，光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)顯示橢圓體帶年均縮窄175μm，ONL年均變薄250μm，早期即存在黃斑中心凹感光細胞外段厚度變薄，或為視力降低最大原因[27]。XLRP臨床基因增強治療試驗主要集中在RPGR，尤其是占RPGR疾病70%以上的ORF15突變[20]。RPGR基因治療于動物模型顯示一定療效，但RPGR固有序列不穩(wěn)定性導致病毒載體克隆過程或發(fā)生不可預測重組錯誤。Fischer等[28]對RPGR基因進行密碼子優(yōu)化，使其具有良好穩(wěn)定性和體外表達水平，來自密碼子優(yōu)化序列的RPGR蛋白中谷氨酰化模式與野生型沒有區(qū)別，即密碼子優(yōu)化不會顯著改變翻譯后修飾。經(jīng)AAV8載體遞送密碼子優(yōu)化RPGR改善Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc兩種小鼠模型表型，并在C57BL6/J野生型小鼠中表現(xiàn)出良好安全性。Song等[29]于野生型和突變小鼠進行了安全性研究，并解決了ORF15不穩(wěn)定性問題。Hu等[30]將攜帶sgRNA和供體模板的AAV載體注射于6mo大Rpgr-/yCas9+/WT雄性小鼠視網(wǎng)膜下，注射后6mo和12mo于治療視網(wǎng)膜區(qū)域觀察到光感受器保留，與未治療視網(wǎng)膜區(qū)域形成顯著對照。Cehajic-Kapetanovic等[31]進行首個人類RPGR-XLRP基因治療劑量遞增試驗，將密碼子優(yōu)化的人RPGR(AAV8-coRPGR)注射于18例患者視網(wǎng)膜下，6mo隨訪結果顯示，全部18例患者治療眼微視野平均增加0.5dB且OCT示ONL厚度增加，與未治療眼形成顯著對照，未發(fā)現(xiàn)明顯劑量相關毒副作用或嚴重不良事件。RPGR基因治療概念驗證及安全性研究已在鼠及犬類動物模型完成，且首個臨床試驗初步結果證實RPGR-XLRP基因治療有效性。另外兩項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗正在進行，但尚未發(fā)表研究相關結果。

3小結

遺傳學技術的發(fā)展使更多RP相關基因被發(fā)現(xiàn)，也為基因治療提供可能。RP基因治療有效性于動物模型試驗證實，幾項臨床試驗正在開展且初步結果顯示有較好療效，為臨床帶來希望。然而在廣泛實施前，必須克服重要挑戰(zhàn)。比如基因載體改良、基因轉移靶向性控制、基因表達產(chǎn)物調(diào)控等，以及治療載體一次性給藥是否能提供長期、持久臨床益處等劑量相關問題尚不清楚。此外，基因治療高度個性化治療形式的昂貴經(jīng)濟成本也是推廣重要阻礙。故而在正式應用于臨床前，RP基因治療仍有前路需要探索。