六神曲酶活性研究進展△

范亞楠，陳彥琳，杜杰，鐘榮榮，孫曉叢，周旭，王奕博

中國中藥有限公司，北京 100195

六神曲又名神曲、六曲，最早收載于《藥性論》[1]，為面粉、麥麩、苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣蓼及蒼耳草混合后經發酵而成的曲劑[2]，其富含維生素B 復合體、消化酶、揮發油、麥角固醇、苷類和黃酮類等活性物質。六神曲主要具有健脾和胃、消食調中等功效[3]，臨床多用于飲食停滯、脾胃虛弱、小兒積食及胸痞腹脹的治療，應用廣泛。

按照現代微生物學的觀點，六神曲的發酵本質上是基質和環境中攜帶的微生物在適宜環境下進行的生物代謝。根據以往研究結果，這些微生物主要為酵母菌、真菌、細菌。微生物為了分解基質，生成自身營養物質，產生木質素酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪以及蛋白酶等多種胞內酶系和胞外酶系。這些酶類可以將基質的成分分解轉化，形成新的成分。六神曲原料并沒有消食的功效，而在發酵后具備了健脾消食的作用，說明藥效作用是由發酵產生，藥效物質為微生物在代謝過程中產生的酶或者代謝產物，這就是六神曲發酵炮制的理論依據[4]。六神曲中主要含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、糖化酶、麥芽低聚糖酶[5]等，可將六神曲基質中的淀粉、蛋白質分解為單糖、低聚糖、氨基酸、小肽，微生物進行物質代謝產生的長鏈脂肪酸類成分也是協助胃腸道行使正常功能，預防胃炎和胃腸道潰瘍的主要成分[6-11]。由于酶的活性大小決定代謝物產生的多少，因此，對于酶活性的監測可有效評價發酵的程度。本文主要從酶活性檢測方法及酶活性研究方法對六神曲的研究進行歸納，旨在為六神曲的深入研究及開發利用提供參考。

1 六神曲酶活性概況

1.1 淀粉酶

淀粉酶是分解淀粉糖苷鍵一類酶的總稱，有α-淀粉酶、γ-淀粉酶、麥芽低聚糖酶等多種酶。

1.1.1α-淀粉酶α-淀粉酶主要作用是水解淀粉分子鏈的α-1，4-葡萄糖苷鍵，切斷成寡糖、短鏈糊精及少量葡萄糖和麥芽糖，使淀粉黏度迅速下降，從而達到“液化”目的。因此，α-淀粉酶又稱液化酶，但其不能作用于支鏈淀粉。產生此酶的微生物主要有細菌、真菌及基因工程菌等[12]。細菌包括枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌，真菌主要是青霉菌、曲霉菌，青霉菌大多為黃青霉，曲霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、煙曲霉。

淀粉酶的測定方法在實際應用中可大致分為2 種，一種方法原理是利用二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該反應產物在高溫條件下顯現棕紅色，且在一定濃度范圍內其顏色深淺與還原糖含量成正比，可以用比色法測定還原糖含量，如DNS 測定法；另一種方法是利用直鏈淀粉和支鏈淀粉遇碘顯色不同，α-淀粉酶的水解活性液中直鏈淀粉和碘反應形成藍色絡合物，支鏈淀粉遇碘則呈現紫紅色。在直鏈淀粉聚合度降低到一定程度時，其與碘的復合物呈紅棕色。在酶底物反應終止后，可以通過測定其吸光度確定α-淀粉酶水解淀粉的程度，如碘法。經查閱文獻發現，最早的六神曲淀粉酶活性研究始于1977年，檢測方法為次亞碘酸定糖法[13]；2004 年，高慧等[14]首次運用碘-淀粉比色法測定淀粉酶活性；2012年，王海洋等[15]引入DNS 測定法測定淀粉酶活性；碘-淀粉比色法及DNS測定法一直延續至今。

1.1.2γ-淀粉酶γ-淀粉酶又稱糖化酶。γ-淀粉酶能從淀粉的非還原端水解支鏈淀粉和長鏈淀粉，水解產物為葡萄糖。產生此酶的微生物為蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、假單胞菌等[16]。

γ-淀粉酶測定方法近年來研究的也較多[17-19]，依據其作用原理大致可分成3 類：測定淀粉水解后的還原產物；測定淀粉的消耗量；色素測定法。其中前2 種方法與α-淀粉酶測定方法原理基本一致，但在實際應用中，γ-淀粉酶的測定方法在六神曲中使用較廣泛的是DNS比色法，該方法反應較靈敏。

1.1.3 麥芽低聚糖酶 麥芽低聚糖酶是淀粉酶的一種，其酶解產物麥芽低聚糖具有抑制腸道有害菌生長的作用。產生此酶的微生物為嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等[20]。

目前，麥芽低聚糖酶活力的測定尚無國家部頒標準，中外文獻資料也未見報道。劉建軍等[21]依據部頒標準γ-淀粉酶的測定方法，制定了麥芽低聚糖酶活力的測定方法。

1.2 蛋白酶

蛋白酶是六神曲中主要消化酶之一，其可以切斷蛋白質分子的肽鍵，使其變成小分子的氨基酸和多肽。產生此酶的微生物主要為枯草芽孢桿菌及曲霉等。

蛋白酶的測定方法多采用福林酚法[22]，福林酚法又稱福林法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色（鉬藍和鎢藍混合物），由于蛋白質分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白質及其水解產物在堿性條件下被還原成藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。

1.3 其他

1.3.1 纖維素酶 纖維素酶（CMC）是一種復合酶，是催化β-1，4-葡萄糖苷鍵水解的一種酶，經酶類共同作用，將纖維素降解為葡萄糖和纖維二糖。其主要由葡聚糖內切酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶3種主要成分組成，濾紙酶（FPA）活力測定法是一種通用的較為經典的測定纖維素酶綜合活力的方法[23-25]，其反映了3 類酶組分的協同作用，統稱FPA 活性。產生纖維素酶的主要是根霉、黑曲霉和木霉等。

FPA 和CMC 的酶活力接近，這可能與藥效成分的抽出和植物破壁有關[26]。測定方法為分別以1% CMC 溶液和whatman NO.1 濾紙為底物，采用DNS比色法測定CMC和FPA的活力。

1.3.2 脂肪酶 脂肪酶可以催化油脂分解為甘油、脂肪酸及甘油單脂或二脂，且能分解或合成高級脂肪酸，并具有多種催化能力，可催化不溶性酯類的醇解、水解、轉酯化、酯化及酯類的逆向合成反應。產生此酶的主要是類酵母、假絲酵母和米根霉等。

脂肪酶活測定方法為以16.5 mmol·L-1對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）溶液為底物，采用pNPP 法測定脂肪酶活力[27]。

2 六神曲酶活性研究進展

2.1 用于比較六神曲不同炮制品差異

有研究者采用碘量法對自制六神曲樣品進行淀粉酶活力測定，結果表明，六神曲生品中的淀粉酶活力比炮制品要高，而炒后蛋白酶活力顯著升高；在改善胃腸動力藥效學實驗方面，生品、制品均能提升病理模型小鼠的小腸推進功能，且生品優于制品[3]。

2.2 用于優化六神曲工藝

2.2.1 用于優化六神曲處方 劉騰飛等[28]采用DNS法測定糖化酶及淀粉酶含量，綜合糖化酶、淀粉酶及蛋白酶指標優選神曲配料比為麩面比70∶30，碳氮比100∶2。高慧等[14]按碘-淀粉比色法對實驗室自制六神曲中淀粉酶活性進行測定，發現不同面粉、麥麩配比的樣品淀粉酶活力有差異，蛋白酶活力、薄層色譜未見顯著差異。考慮到曲料的黏性、拌曲的難易程度及原料的經濟性，選面粉∶麥麩=25∶75為最佳配比。此結果與劉騰飛等[28]研究的麩面比結果幾乎吻合。王麗芳等[29]采用相同方法測定淀粉酶活性，結果顯示，無論是在28 ℃還是33 ℃下發酵，鮮品組淀粉酶及脂肪酶活力峰值都明顯高于干品組，組間差異有統計學意義。其中，鮮品煎汁組略高于鮮品榨汁組，六神曲用鮮品組方入藥優于干品組。

除此之外，戚岑聰等[30]在六神曲發酵過程的質量監測中運用近紅外光譜分析技術，結果表明，運用近紅外光譜技術對蛋白酶、淀粉酶活力進行定量分析，和傳統的分析方法所得結果之間具有較好的相關性。而且，建立的模型在全面粉發酵組與麥麩面粉比例1∶1 發酵組中均有較好的適用性，可以考慮將模型進一步推廣。

2.2.2 用于優化六神曲發酵工藝 徐云等[26]運用DNS 比色法發現，發酵過程中產生的消化酶存在一定變化規律：纖維素酶、淀粉酶及脂肪酶的活力在發酵4 d時達到峰值，糖化酶活力在發酵第三天時達到峰值，而后4 種酶活力都有下降的趨勢并逐漸趨于平穩；而蛋白酶活力在發酵前4 d 并沒有顯著變化，且隨著發酵時間的延長蛋白酶活力顯著升高。因此，最終確定六神曲的發酵工藝時間為4～6 d。張紅玲等[31]采用碘-淀粉比色法研究了由四川輔正藥業公司提供的8批六神曲自制發酵品（發酵天數為8 d，每天取樣），結果發現，糖化酶及淀粉酶活力在4 d達到最高值，而蛋白酶活力在第五天達到最高值，并選六神曲發酵第四天的樣品進行藥理實驗，發現其對小鼠胃腸運動有顯著影響，因此，六神曲最佳發酵時間為4 d 左右。劉騰飛等[32]采用DNS 比色法，按照《全國中藥炮制規范》的方法制備六神曲，考察在赤小豆加入量、發酵時間及發酵溫度單因素的基礎上，運用Box-Behnken響應面設計試驗，篩選出最佳發酵工藝參數為赤小豆加入量2.6 g·（100 g）-1、發酵溫度為32 ℃、發酵時間3 d。王海洋等[15]按照《全國中藥炮制規范》制備六神曲，采用相同方法對淀粉酶活力進行測定，結果發現，發酵溫度控制在30～37 ℃時，最佳發酵時間為7 d；赤小豆的最佳處理方法為煮爛拌曲；青蒿、辣蓼、蒼耳草的最佳添加方式為以鮮品水煎液混合均勻后拌曲，發酵后六神曲的淀粉酶活力明顯高于市售的2 種六神曲樣品。劉曉瑜等[33]采用福林酚法測定蛋白酶活力，綜合蛋白酶、淀粉酶的活力和高效液相色譜法（HPLC）特征圖譜，結果發現，六神曲最佳發酵的相對濕度為80%，中藥汁加入量為0.65 mL·g-1。

2.3 用于篩選六神曲發酵菌種

鄔吉野等[2]運用碘-淀粉比色法檢測酶活性發現，六神曲原料中不含淀粉酶、蛋白酶，而黃曲霉純種發酵能顯著升高六神曲中2 種酶的酶活力。有研究者采用相同方法測定淀粉酶活性[34]，研究發現，毛霉菌可以提高按照傳統工藝制作的六神曲樣品中淀粉酶及蛋白酶活力，因此，認為毛霉菌為進行六神曲純種發酵的最優菌種。程亦雄等[35]則采用福林法測定蛋白酶活力，發現分離得到的賽氏曲霉菌落質地綠色呈絨毛狀，表面附有黃色滲出物，在發酵過程伴有輕微的酸性氣味散出，且產蛋白酶的活性明顯優于淀粉酶活性，因此，認為賽氏曲霉菌落可作為優選菌種進行發酵實驗。

2.4 用于比較六神曲不同工藝差異

六神曲的制作工藝各地藥品標準要求不一，其差異主要體現在原料配比與生產條件上。王云庭等[5]首次以麥芽低聚糖酶活力為考察指標，比較不同產地六神曲樣品中生品、制品的麥芽低聚糖酶活力，結果發現，六神曲不同產地的麥芽低聚糖酶活力有顯著差異。其中，生品六神曲酶活力最高的為廣西，最低的為四川，同一產地的六神曲樣品生品酶活力大于炮制品。張鵬等[36]收集了6個不同產地六神曲市售樣品，采用碘-淀粉比色法發現，不同產地六神曲樣品淀粉酶活力差異顯著，為200～500 U，范圍跨度較大。

3 展望

六神曲是臨床常用中藥飲片，但仍未被《中華人民共和國藥典》2020 年版收載。部頒標準也只收載了其組方配比及制作方式，同時僅憑外觀和經驗來評價質量。經過文獻調研發現，六神曲的生產來源不盡相同，許多廠家未經衛生部門的允許擅自生產，并且六神曲質量評價體系尚不完善，導致市售六神曲樣品的質量差異較大，市場上偽劣產品較多。目前，六神曲的評價指標主要為性狀、鑒別、檢查、浸出物、指紋圖譜等，但由于其藥材來源復雜及工藝的特殊性，建議應該引入消化酶作為評價指標。根據文獻報道，對六神曲中蛋白酶及淀粉酶研究較多，但根據本實驗室前期研究發現，已確定優勢菌種為扣囊和米根霉，其中米根霉可產生纖維素酶和脂肪酶，這2 個指標在發酵工藝中還沒被監測過。因此，日后將重點研究纖維素酶和脂肪酶活性，同時建立測定方法，以確保實驗方法穩定可靠，從而進一步控制和評價六神曲的質量，為其臨床用藥安全有效提供參考。