三氧化二砷對人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 教化單核細(xì)胞的影響

季秋蘭，丁景弦（通信作者）

1 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院老年科 （江西南昌 330003）；2 南昌市第三醫(yī)院放療科 （江西南昌 330025）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，現(xiàn)階段，其發(fā)病率仍呈持續(xù)升高的趨勢。在歐美等發(fā)達(dá)國家，乳腺癌占女性惡性腫瘤的25%～30%[1]；與西方國家不同，我國乳腺癌的發(fā)病率呈雙峰分布，第一高峰為40～45歲，相較于多發(fā)于婦女絕經(jīng)后的西方國家提早了10～15年[2-3]。

腫瘤免疫治療相關(guān)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，有望通過激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)徹底清除腫瘤細(xì)胞[4]。然而，臨床實(shí)踐顯示，腫瘤免疫治療反應(yīng)性差異很大，最主要的原因可能是患者腫瘤微環(huán)境中存在較強(qiáng)的免疫抑制狀況，使浸潤的T 淋巴細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞的能力下降[5]。腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage, TAM）具有抑制腫瘤免疫的作用，其豐度是乳腺癌獨(dú)立的不良預(yù)后因素[6]。

TAM 由單核細(xì)胞經(jīng)替代途徑活化、分化而來，通常具有M2型免疫表型，表達(dá)CD163。巨噬細(xì)胞集落刺激因子1（macrophage colony-stimulating factor 1，CSF1）是目前已知的參與單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞活化、分化的細(xì)胞因子[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231 CSF1的表達(dá)水平明顯高于激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）能逆轉(zhuǎn)三陰性MDA-MB-231的激素受體狀態(tài)從而減弱其惡性生物學(xué)行為。本研究擬探討As2O3對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞教化單核細(xì)胞定向分化為M2型TAM的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231原購自美國ATCC細(xì)胞庫，U937細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)馬端教授饋贈，GFP-PURO雙標(biāo)穩(wěn)定表達(dá)U937細(xì)胞系及RFP-NEO 雙標(biāo)穩(wěn)定表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞系由本課題組前期建立。

1.1.2 藥物和試劑

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（Gibco 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），As2O3（Sigma 公司），CSF1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen），RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（日本TaKaLa 公司）。

1.1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱購自Thermo 公司，Transwell 板購自康寧公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將含5×104個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞的完全培養(yǎng)基200 μl 接種于96孔板中，24 h 后吸出培養(yǎng)上清，向其中分別加入100 μl 無血清培養(yǎng)基或濃度分別為2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3培養(yǎng)液100 μl，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集上清， 以200 g 離心5 min 除去細(xì)胞碎片，收集上清放于-80 ℃冰箱中保存待行ELISA 檢測。

1.2.2 CSF1濃度檢測

本實(shí)驗(yàn)利用Invitrogen 公司CSF1 ELISA 試劑盒檢測不同培養(yǎng)上清中單核細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子CSF1濃度，實(shí)驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說明書操作流程進(jìn)行。

1.2.3 MDA-MB-231細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng)

將5×105個(gè)U937細(xì)胞接種于Transwell 板（24孔，孔徑5 μm）上室中，下室種不同處理組5×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞，共培養(yǎng)24 h 后于熒光顯微鏡下觀察空白對照組、不同濃度As2O3處理組MDA-MB-231細(xì)胞對U937細(xì)胞趨化運(yùn)動的影響。

將不同實(shí)驗(yàn)組中5×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞接種于Transwell 板（6孔，孔徑0.4 μm）上室中，下室種5×105個(gè)U937細(xì)胞，共培養(yǎng)24 h 后檢測空白對照組、不同濃度As2O3處理組MDA-MB-231細(xì)胞對U937細(xì)胞CD163基因表達(dá)的影響。

1.2.4 CD163的表達(dá)檢測

針對共培養(yǎng)24 h 后的U937細(xì)胞與不同處理組MDAMB-231細(xì)胞，利用總RNA 提取試劑盒Trizol 按實(shí)驗(yàn)流程提取總RNA，利用TaKaLa 試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測不同處理組U937細(xì)胞CD163表達(dá)的差異。GAPDH 作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段引物系列見表1，PCR 反應(yīng)條件參考既往發(fā)表文獻(xiàn)[7]。

表1 引物系列及其產(chǎn)物片段長度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度As2O3處理對MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)CSF1的影響

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h 后培養(yǎng)上清中CSF1的濃度分別為（266±28）、（242±28）、（204±12）、（127±10）、（94±13）、（82±22）、（54±17）ng/L，不同處理組間CSF1濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54，P＜0.01），見圖1。

圖1 ELISA 檢測As2O3 對MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)上清中CSF1 濃度的影響

2.2 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞對共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞趨化的作用

0、6、12 μmol/L 的As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h 后共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞遷移能力隨著濃度遞增而減弱，見圖2。

圖2 在共培養(yǎng)體系中不同濃度As2O3 處理MDA-MB-231 細(xì)胞對U937 單核細(xì)胞株趨化作用的差異

2.3 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞對共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞CD163表達(dá)的影響

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L的As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞CD163 mRNA的表達(dá)水平分別為100.0%、83.5%、73.8%、48.3%、36.5%、17.6%、8.7%，不同處理組間CD163 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120，P＜0.01），見圖3。

3 討論

三陰性乳腺癌約占女性乳腺癌的16%，目前尚未發(fā)現(xiàn)特定治療靶點(diǎn)，總體預(yù)后較差。TAM 是腫瘤微環(huán)境中的重要細(xì)胞組成成分，主要通過促進(jìn)新血管生成和瘤旁炎癥反應(yīng)等來發(fā)揮其在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中TAM 豐度較高，體外實(shí)驗(yàn)也表明三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231誘導(dǎo)單核細(xì)胞株U937分化為TAM 的能力較強(qiáng)[6-7]。As2O3具有誘導(dǎo)分化作用，文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道其能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 ERα 啟動子中的CpG 島發(fā)生去甲基化，恢復(fù)表達(dá)雌激素受體。

圖3 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h 后對共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞表達(dá)CD163的差異

本研究通過Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)，利用相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)As2O3能下調(diào)CSF1的表達(dá)，從而減弱其教化單核細(xì)胞分化、活化為M2型巨噬細(xì)胞的能力。這為三陰性乳腺癌患者的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)有望開展相關(guān)臨床研究，進(jìn)一步探討As2O3治療三陰性乳腺癌患者的安全性和有效性。