動物疫苗佐劑應用進展概述

張 榮，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，安芳蘭，劉學榮

（中農威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

佐劑在動物和人疫苗技術中起著非常重要的作用，目前已有許多有機、無機、合成和天然來源的化合物證明具有刺激免疫反應和有效佐劑特性的能力。其大致可以分為2類：免疫增強劑類（Toll樣受體激動劑，皂苷，細胞因子）和遞送劑類（乳劑，微粒，礦物鹽）[1]。免疫增強劑刺激抗原遞呈細胞（APCs）促進各種細胞因子的分泌，而遞送劑可以保存抗原的構象并將其遞送給APCs，并為抗原的緩慢釋放提供持續的免疫刺激。例如，TLR激動劑和其他免疫刺激物質可增強免疫細胞的募集和細胞因子的分泌，而乳劑和礦物鹽可在注射部位產生存儲效應，延長抗原的釋放時間并持續刺激免疫細胞。

因為涉及成本效益，食用動物疫苗的研發不同于人和其他動物疫苗。從安全出發，例如在人類疫苗中Quil-A和礦物油乳劑等化合物是被限制使用的，但已被廣泛運用于畜牧業疫苗中[2]。本文重點對商業化疫苗佐劑和目前正在研究的動物疫苗佐劑進行了概述，并探討了佐劑之間的協同效應及其作用機制。

1 礦物鹽

鋁鹽是最早用于疫苗的佐劑之一，能誘導高滴度的IgG抗體，且作用時間相對較長，易于配制。鋁佐劑可以促進白細胞介素分泌刺激Th2免疫應答的細胞因子IL-4，從而誘導IgG1和IgE免疫球蛋白以及嗜酸性粒細胞的產生，因此成為抗菌和抗寄生蟲疫苗的理想候選佐劑。為了提高鋁鹽對抗病毒性疾病的有效性，它與其他佐劑聯合給藥以刺激Th1細胞介導反應的策略已在許多研究和臨床試驗中使用[3]。鋁佐劑廣泛運用在商用的人和動物疫苗中，可以預防具有重要經濟意義的動物疫病，如新城疫和口蹄疫（FMD）等。

磷酸鈣是另一種市售礦物鹽佐劑，已運用在對抗各種類毒素和病毒病原體的疫苗生產中。與鋁佐劑相比，磷酸鈣對局部組織的刺激較小，IgE抗體產生減少。在小鼠和豚鼠模型中，用磷酸鈣納米顆粒給藥的DNA疫苗可誘導足夠的體液和細胞介導的免疫應答，以保護動物免受口蹄疫的致死感染，以磷酸鈣為佐劑的新城疫滅活疫苗產生保護性免疫的效果低于以天然高分子殼聚糖為佐劑的疫苗[4]。

礦物鹽類佐劑在人類和動物疫苗學研究中具有較長的歷史，是相對安全和經濟的一類佐劑[5]。雖然在對抗細胞外病原體的疫苗中表現出良好的佐劑性能，但在針對細胞內細菌感染的疫苗中的應用卻有限。

2 乳劑

當2種不混溶的液體混合在一起時就形成了乳劑，其中一種可以組成小液滴，分散在另一種液滴中，并由兩者界面上的表面活性劑層來穩定其結構。因為其相對易生產，成本較低，并在產生抗體的應答中表現出良好的效能，所以乳劑是動物疫苗佐劑的一個優良選擇。

不同類型的乳劑在疫苗中的作用機制也不同，油包水（W/O）乳劑是水滴在連續油相中的分散體，抗原被包裹在水相中，周圍是連續的油相，注入機體后隨著油的分解緩慢釋放，可以延長免疫細胞募集和抗原加工的時間。最典型的W/O型佐劑是弗氏佐劑，它可以有效誘導高效價抗體應答，但會產生強烈的不良反應，如局部炎癥病變和疼痛等，限制了其在動物和人疫苗中的廣泛應用。法國SEPPIC公司的Montanide（ISA）佐劑是做得最好的商業化W/O乳劑，ISA含有提純的礦物油或角鯊烯油，與甘露醇酯作為乳化劑，副作用小，被廣泛用于獸用疫苗的生產和研發。例如在雞新城疫疫苗和豬肺炎支原體亞單位疫苗、豬和牛滅活口蹄疫疫苗以及由各種病毒和細菌感染的養殖魚類疫苗中使用的都是Montanide的W/O佐劑[6]。

對于水包油（O/W）乳劑，油滴分散在水相中，與W/O乳劑不同的是，O/W乳劑在注射部位不會形成抗原庫。O’Hagan DT等[7]對MF59（一種角鯊烯O/W疫苗佐劑）的研究揭示了O/W乳劑誘導免疫應答的機制，與氫氧化鋁和磷酸鈣相比，在對流感病毒刺激細胞免疫反應中，MF59具有更好的適應性。在獸醫應用中，一些商業化的O/W佐劑被廣泛用于家畜疫苗的制備中，來抵抗各種具有經濟意義的細菌和病毒引起的疾病[8]。Horohov DW發現[9]與以磷酸鋁為佐劑的滅活馬流感疫苗相比，MetaStim對IL-12和IFN-γ的表達有較高的促進作用。因此，與無機鹽相比，O/W乳劑是更適合用于對抗病毒病原體的疫苗佐劑。

在雙相乳劑水包油包水（W/O/W）中，含有內部水滴的油滴分散成連續的水相，這種乳劑可以同時提供抗原從外部水相的快速釋放和從內部水相的延長釋放，可以快速、持續地刺激免疫細胞。目前市場上的W/O/W型乳劑還比較少，獸用疫苗中應用最廣泛的就是Montanide ISA 201和Montanide ISA 206，與抗原在溫和條件下混合后制備疫苗，保護不同種類的牲畜免受幾種經濟上重要的病原體（如流感病毒和口蹄疫病毒）感染[10]。

乳劑是獸用疫苗中非常有前景和市場的佐劑，該佐劑的成分廉價、較易獲得，如礦物油和食品級乳化劑，但乳劑的物理特性與其誘導動物免疫反應的能力之間的關系還需要進一步研究。

3 Toll樣受體激動劑

TLRs是在巨噬細胞和樹突狀細胞中表達的膜附著受體，能夠識別微生物的特定成分并啟動宿主固有的防御機制。某些細菌來源的成分可以誘導特異性免疫反應，TLRs的激活可以通過誘導特定細胞因子的表達，參與抗原特異性免疫來誘導T細胞的分化。

脂多糖（LPS）是一種TLR4激動劑，能刺激APCs分泌激活Th1細胞的細胞因子，如IL-1β、IL-12、IL-18等，這些細胞因子介導細胞免疫和體液免疫，對抗病毒和其他細胞內的病原體。細菌脂蛋白被TLR2識別，Rau H等[11]在CSF亞單位疫苗中使用銅綠假單胞菌膜脂蛋白OprI，OprI通過TLR2介導的APCs的激活和成熟促進T細胞應答和體液反應。細菌鞭毛蛋白是一種TLR5激動劑，具有佐劑特性，Qi Y等[12]將細菌鞭毛蛋白與狂犬病毒樣顆粒聯合使用時，鞭毛蛋白和不耐熱細菌腸毒素均能促進病毒特異性中和抗體和CD4+、CD8+T細胞的產生。將大腸桿菌不耐熱腸毒素作為亞單位豬流感疫苗的佐劑，TLR9能夠識別細菌DNA中的CpG基序，并誘導T細胞免疫，CpG寡脫氧核苷酸（ODNs）與TLR9相互作用，通過誘導IL-12和IFN-γ刺激Th1應答[13]。細菌菌影（BGs）是由革蘭氏陰性菌的細菌空殼制備的非活細胞，是基于TLR激動劑的另一種佐劑，不含保留細胞形態的細胞質內容物和表面抗原。Xia S等[14]用含有BG佐劑的嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2治療的豬對CSF病毒的攻擊具有完全保護，不含BG的疫苗對豬的保護作用有限，但是用添加BG佐劑的疫苗免疫豬，豬會產生短暫的過敏反應。

雖然TLR激動劑在獸藥疫苗技術中廣受研究者的關注，但其在應用上也面臨著巨大的挑戰。通過病原體識別受體（PRRs）過度激活先天免疫系統可導致敗血性休克，與FIA相比，FCA中熱殺滅分枝桿菌的存在能促進更高的抗體反應，但用重組細菌鞭毛蛋白與O/W乳劑聯合應用于抗惡性卡他熱疫苗，可在牛中誘導免疫抑制機制，與未接種鞭毛蛋白疫苗相比，死亡率更高[15]。因此，在安全性和有效性之間找到正確的平衡是今后佐劑研究面臨的挑戰。

4 免疫反應化合物

4.1 細胞因子

細胞因子是TLR激動劑介導的免疫反應的關鍵因子，在動物疫苗中使用細胞因子作為疫苗佐劑正在進行更深入的研究，這些小蛋白在細胞信號傳導、誘導和指導細胞免疫和體液免疫應答中起著至關重要的作用。例如，IL-2、IL-12和IFN-γ可促進Th1細胞介導細胞免疫應答；IL-4、IL-5和IL-10可促進Th2細胞的發育和抗體的產生，防御細胞外病原體；IFN-γ還可通過誘導APCs上主要組織相容性復合體（MHC-II）分子的表達，增強抗原的攝取和遞呈[16]。Fan Y等[17]用IFN-γ作為佐劑制備CSF減毒疫苗免疫豬，與單獨接種減毒疫苗組進行比較，可顯著提高抗CSF病毒IgG抗體水平，并增加MHC-I和MHC-II的表達。

細胞因子還用在家禽、牛和魚類的各種病毒性疾病的疫苗生產中，Huo S等[18]在新城疫疫苗中加入了IL-18和在傳染性法氏囊病DNA疫苗中加入了IL-7。IL-18可用作牛口蹄疫DNA疫苗的佐劑，誘導牛細胞介導的抗體應答。Chang C等[19]發現用含有鮭魚貧血病毒蛋白和魚I型干擾素的DNA疫苗免疫大西洋鮭魚，與未使用細胞因子的DNA疫苗相比，可誘導更高水平的抗體及B細胞和CD8+T細胞的流入和匯集。

4.2 皂苷

皂苷是由親脂性三萜衍生物上附著的一種或多種親水糖苷基組成的兩親性化合物，這些天然物質在許多醫藥行業中都有應用，皂苷具有刺激免疫反應的能力，因此可以作為動物疫苗佐劑。應用最廣的皂苷佐劑是Quil-A，它是一種水溶性皂苷的非均相混合物，從南美洲本土的一種樹中提取，由于毒性較強，Quil-A不適合用于人類疫苗，卻被廣泛用于獸用疫苗。研究證明，在口蹄疫和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的疫苗中，添加Quil-A的疫苗跟未添加Quil-A的疫苗相比，免疫原性顯著增強[20]。QS-21是皂苷的純化部分，作為佐劑正用于許多人類癌癥和傳染性疫苗的臨床試驗中，一種商業化的貓白血病疫苗中也使用了QS-21。

Quil-A和QS-21通過刺激Th1和細胞毒淋巴細胞引起細胞介導的免疫反應，誘導小鼠產生IgG1和IgG2a抗體。在研究皂苷的結構成分與其免疫功能之間的相互聯系方面已做了大量工作，皂苷的糖基可以與APCs上的凝集素結合，促進抗原吞噬和刺激APCs分泌細胞因子，激活體液和細胞介導的免疫應答。對于家畜應用而言，在自然界中尋找毒性較小的皂苷類化合物在經濟上更可行。

4.3 聚合物

聚合物除了在疫苗中作為運載工具保護抗原，并在注射后提供可控釋放外，有些還可以作為免疫增強劑，本文主要列舉一些具有免疫活性可作為獸用疫苗佐劑的天然和合成高分子物質。殼聚糖在疫苗中主要作為抗原顆粒載體出現，對其免疫特性進行研究發現，殼聚糖分子可以與巨噬細胞上的甘露糖受體結合激活炎性小體，啟動補體途徑。Pan L等[21]用含殼聚糖佐劑的口蹄疫疫苗滴鼻免疫牛，可防止口蹄疫病毒的直接接觸感染。

聚丙烯酸聚合物（Carbomers）如Carbopol，它的佐劑特性首次在小鼠接種試驗中得到驗證，目前作為佐劑應用于抗馬流感病毒、抗豬圓環病毒2型疫苗與肺炎支原體疫苗等滅活疫苗和基于載體的獲批疫苗中。Mair KH等[22]發現Carbopol可有效促進豬接種改良PRRS病毒活疫苗后IFN-γ的產生和T細胞的分化。此外，Carbopol能夠捕獲并緩慢釋放刺激免疫細胞的抗原分子。

聚磷腈是一類主要由磷和氮原子交替組成的無機—有機聚合物，代替抗原庫效應，聚磷腈聚合物傾向于與抗原分子形成非共價鍵，有助于抗原遞送到APCs，使得在注射部位促炎細胞因子和趨化因子的分泌增加。雖然聚磷腈在實驗動物中結果較好，但要在畜牧動物中大量使用數據仍有限。Dar A等[23]發現，與O/W乳劑疫苗相比，聚磷腈佐劑胸膜肺炎放線桿菌疫苗能提高豬IgG抗體滴度和IFN-γ的產量，并且在豬的注射部位不會引起炎癥。

由于聚合物比乳化劑更安全，并能誘導細胞介導的免疫反應，這對宿主抵御病毒病原體非常重要。因此，聚合物在獸用疫苗預防病毒感染中是非常有潛力的候選佐劑。

4.4 組合佐劑

在一種疫苗中同時使用2種或2種以上的佐劑可增強免疫效果，將幾種佐劑聯合使用已經處于人類和動物傳染病疫苗臨床試驗的不同階段，Ren J等[24]評估了細菌CpG基序與O/W或W/O/W乳劑結合作為禽流感和FMD疫苗佐劑系統的效果，發現與單獨使用這些佐劑相比，組合佐劑可以誘導更高水平的中和抗體，乳劑可持續釋放抗原和CpG ODNs，從而激活IFN-γ分泌淋巴細胞。皂苷和乳劑的組合使用能提高口蹄疫疫苗的效力，用含有QS-21的W/O/W乳劑疫苗免疫奶牛，QS-21可加速抗FMDV中和抗體的產生。用皂苷和乳劑的組合佐劑制備口蹄疫疫苗免疫小鼠，Song X等[25]發現會誘導產生更高滴度的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體。

雖然增強免疫效果的組合佐劑已經在實驗室得到驗證，但還需要進一步研究來確認其在大型動物中的安全性和有效性。此外，必須徹底評估不同佐劑對生產成本的影響，才能將其應用于商業化動物疫苗中。

5 結語

本文詳細闡述了礦物鹽、乳劑、Toll樣受體激動劑、免疫反應化合物及聚合物等幾種商業化佐劑的主要成分、作用機理、應用范圍及適宜動物等。許多天然和合成物質都有提高動物疫苗免疫效力的作用，可以作為佐劑使用。其中鋁化合物、乳劑、皂苷和卡波姆已經在部分特許產品中商業化使用，而其他像細胞因子和聚磷腈等仍在實驗室階段。因此，在動物疫苗佐劑的選擇中應考慮以下幾個因素：對目標動物的有效性、誘導一種快速并持久的保護性免疫、對動物的安全性、是否符合食品安全法規、擴大生產的可行性、成本效益等。由此看來，尋找合適的佐劑或其組合以滿足以上因素是未來動物疫苗開發中面臨的重要挑戰。