BATF2真核表達載體的構建及其對肝癌細胞Bel-7402增殖的影響

張暢　周浮楊　鄭宇航　魏超越　王瓔珞　孫艷

【摘要】 目的：構建人BATF2真核表達載體，并驗證其過表達對肝癌Bel-7402細胞增殖的影響。方法：利用Trizol法提取正常人外周血單核細胞RNA并將其反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板擴增出BATF2基因序列，再將其連接到pcDNA3.1真核表達載體上，采用酶切和測序的方法對重組質粒進行鑒定;用脂質體轉染的方法將重組質粒轉染Bel-7402細胞后，Western blot檢測BATF2蛋白表達變化，MTT法檢測對細胞增殖的影響。結果：雙酶切和DNA測序結果驗證了pcDNA3.1-BATF2真核表達載體構建成功;pc-DNA3.1-BATF2組BATF2蛋白表達量高于空白對照組與pcDNA3.1組（P<0.05）。轉染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2組Bel-7402細胞增殖的OD值均低于空白對照組和pcDNA3.1組（P<0.05）。結論：成功構建pcDNA3.1-BATF2真核表達載體并轉染Bel-7402細胞后BATF2蛋白表達量增加，且過表達BATF2能夠顯著抑制肝癌細胞Bel-7402細胞增殖能力。

【關鍵詞】 BATF2 真核表達載體 Bel-7402細胞 細胞增殖

[Abstract] Objective： To construct the eukaryotic expression vector of human BATF2 and verify the effect of its overexpression on the proliferation of hepatoma Bel-7402 cells. Method： The RNA of normal human peripheral blood mononuclear cells was extracted by Trizol method and reverse transcribed into cDNA. The BATF2 gene was amplified by the cDNA template， and then linked to pcDNA3.1 eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by the method of liposome transfection. After the recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by liposome transfection， the expression of BATF2 protein was detected by Western blot and the effect on cell proliferation was detected by MTT method. Result： The results of double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-BATF2 was successfully constructed. The protein expression of BATF2 in pc-DNA3.1-BATF2 group was higher than those in blank control group and PCDNA3.1 group （P<0.05）. After transfection for 48， 72 and 96 h， the OD values of Bel-7402 cell proliferation in pcDNA3.1-BATF2 group were lower than those in blank control group and pcDNA3.1 group （P<0.05）. Conclusion： pcDNA3.1-BATF2 eukaryotic expression vector is successfully constructed and transfected into Bel-7402 cells to increase the expression of BATF2 protein， and the overexpression of BATF2 can significantly inhibit the proliferation ability of Bel-7402 cells.

[Key words] BATF2 Eukaryotic expression vector Bel-7402 cells Cell proliferation

First-author’s address： School of Basic Medical Science， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.007

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其具有高復發、高病死率等特點，嚴重危害患者的身心健康[1]。肝癌的發生與其他癌癥一樣，是一個多步驟、多因素共同作用所引起的復雜病理過程[2]。科學家們一直致力于挖掘肝癌的發病機制及其治療方法，而抗癌基因的研究一直是肝癌研究的熱點。堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子2（BATF2）是2008年由Su等[3]通過差減雜交技術發現的抑癌基因，其因結構與激活轉錄因子ATF相似而得此命名。BATF2被檢測到在多種組織中廣泛表達，而在多種腫瘤細胞中表達下降或缺失，其與多種腫瘤的發生發展關系密切[4]。目前關于BATF2與肝癌的相關報道相對較少，其在肝癌中的具體分子機制有待闡明。因此本研究構建了pcDNA3.1-BATF2過表達載體并轉染肝癌細胞Bel-7402，以觀察BATF2對肝癌細胞Bel-7402細胞增殖的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞株Bel-7402（購于中科院上海細胞生物學研究所）。儀器和試劑：電子天平（METTLER TOLEDO）、酶標儀（瑞士Tecan）、低溫離心機（德國eppendorf）、BATF2抗體和GAPDH抗體（武漢三鷹）、羊抗兔二抗（Abacm）、MTT粉末（Sigma）、RPMI-1640培養基和胎牛血清（Hyclone）、6孔細胞培養板和96孔細胞培養板（Corning）、DMSO（Solarbio）。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-BATF2質粒的構建及鑒定 利用Trizol法提取正常人外周血單核細胞RNA并將其反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板，利用高保真酶將BATF2全長序列通過PCR擴增出來。BATF2引物序列包括：上游引物BATF2-F：5’-GCTCTAGAATGCACCTCTGTGGGGGCAATGG-3’（XbaI）;下游引物BATF2-R：CGGAATTCTTAGAAGTGGACTTGAGCAGAGGAG（EcoRI），片段大小為825 bp。擴增條件：PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳對目的基因進行回收，利用XbaI和EcoRI對pcDNA3.1-HA空載體和目的基因進行雙酶切，再一次通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收雙酶切片段。利用T4 DNA連接酶將目的基因連接到線性化的pcDNA3.1上，

16 ℃連接過夜。將連接后產物用熱激發轉化到DH5α感受態中，涂布在含氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，挑取單克隆培養后提取質粒進行雙酶切鑒定并將酶切開的質粒測序。

1.2.2 細胞培養 用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養基，置于5% CO2、37 ℃恒溫恒濕的培養箱內培養，每天換液1次。

1.2.3 pcDNA3.1-BATF2質粒轉染 將5×105個/孔的Bel-7402細胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL RPMI-1640完全培養液，待細胞達到90%融合度時，棄去培養基，每孔加入500 μL Opti-MEM培養基。依照Lipofeetamine 3 000 Reagent說明書進行pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-BATF2質粒的轉染。

1.2.4 Western blot檢測BATF2蛋白的表達 轉染48 h后收集轉染細胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，應用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。定量后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，然后加一抗37 ℃孵育5 h，TBST洗滌4次，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL顯影，凝膠成像系統拍照。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖 細胞轉染后繼續培養48 h，消化細胞，5 000個/孔接種于96孔板中，細胞完全貼壁后每隔24 h使用MTT試劑對細胞增殖情況進行檢測。檢測時，每孔加入20 μL MTT試劑，37 ℃孵育4 h，490 nm波長檢測OD值。

1.3 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BATF2載體的構建及鑒定 提取pcDNA3.1-BATF2質粒，經XbaI和EcoRI雙酶切后可在832 bp處觀察到特異性條帶，與預期結果一致。雙酶切以及測序結果顯示pcDNA3.1-BATF2表達載體構建成功。見圖1、2。

2.2 轉染pcDNA3.1-BATF2質粒后BATF2表達的鑒定 Western blot結果顯示，空白對照組BATF2相對表達量為（0.082±0.009），pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組BATF2相對表達量分別為（0.086±0.011）、（0.301±0.028）;pc-DNA3.1-BATF2組BATF2蛋白表達量高于空白對照組與pcDNA3.1組（P<0.05）。見圖3。

2.3 過表達BATF2對Bel-7402細胞增殖的影

響 MTT結果顯示，空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉染24 h后OD值分別為（0.354±0.012）、（0.346±0.021）和（0.337±0.017）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉染48 h后OD值分別為（0.685±0.024）、（0.712±0.019）和（0.614±0.019）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉染72 h后OD值分別為（0.912±0.026）、（0.866±0.028）和（0.712±0.023）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉染96 h后OD值分別為（1.014±0.031）、（0.995±0.034）和（0.753±0.025）。轉染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2組Bel-7402細胞增殖的OD值均低于空白對照組和pcDNA3.1組（P<0.05）。見圖4。

3 討論

肝癌已成為全球惡性腫瘤發病率第六位的腫瘤，其病死率更是排在了第四位，世衛組織預測2030年全球范圍內死于肝癌的人數將達到100多萬[5]。2018年全球新發肝癌病例約有84萬例，死亡病例約有78萬[6]。我國又是一個肝癌大國，肝癌患者的發病率和死亡率都超過了世界平均水平[7]。2018年我國新發肝癌病例約39萬，占全球肝癌新發病例的46.71%，死亡病例約37萬，占全球肝癌死亡病例的47.20%[6]。雖然近年來對肝癌的治療取得了巨大的進展，但其仍然嚴重威脅著患者的健康和生命安全。腫瘤的發生發展是一個復雜的生物學過程，伴隨著抑癌基因的失活和原癌基因的激活[7-8]。抑癌基因在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，抑癌基因能夠通過阻滯細胞周期、促進細胞凋亡來控制腫瘤細胞異常增殖，除此之外，某些抑癌基因還能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，從而發揮抑癌的功能[9-12]。因此研究抑癌基因在肝癌發生發展中的作用對于肝癌的預防和治療具有重要意義。

BATF2基因由3個外顯子組成，共含有2 142個堿基對，其編碼274個氨基酸殘基的蛋白質[13]。AP-1能夠調控正常細胞的癌性轉染，在癌癥的發生發展中發揮重要作用，報道顯示，AP-1在90%以上的惡心腫瘤中存而BATF2能夠與AP-1結合，但由于其沒有轉錄激活結構域，使得AP-1不能起始轉錄，從而起到抑制AP-1活性的作用[14-16]。早期研究發現BATF2與前列腺癌、肺癌、肝癌、結直腸癌等多種惡性癌癥的發生和預后有著密切的關系，其在這些癌癥中常被檢測到表達缺失，而在這些癌癥對應的正常細胞中卻被檢測到表達穩定[17]。Ma等[18]研究發現BATF2表達陽性的肝癌患者平均生存時間顯著高于BATF2表達缺失的患者，并且BATF2表達與腫瘤分期和患者年齡具有相關性。Liu等[19]在結直腸癌細胞系中過表達BATF2，結果發現BATF2在抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡的同時還能夠抑制癌細胞的遷移和侵襲。

目前國內外關于BATF2在肝癌中的作用研究鮮有報道，本研究從正常人外周血單核細胞中調取了BATF2基因全長編碼序列，并連接到了pcDNA3.1真核表達載體上，成功構建了pcDNA3.1-BATF2重組質粒，并通過雙酶切法和測序法進行了驗證。通過Lipofectamine 3 000 Reagent轉染試劑將重組質粒轉入肝癌細胞Bel-7402后，經Western Blot鑒定，轉染前后BATF2蛋白表達水平變化明顯，進一步驗證了pcDNA3.1-BATF2重組質粒構建成功。薛龑等[20]研究發現慢病毒轉染BATF2基因48 h后，過表達BATF2的人紅白血病Kasumi-1細胞增殖速度減慢，并且在72 h后與NC組細胞增殖速度出現顯著差異（P<0.05）。該發現與本研究一致，過表達BATF2同樣也能夠抑制肝癌Bel-7402細胞的增殖，說明其在肝癌的發生發展中發揮作用，但其具體作用機制還需要進一步研究。

總之，本研究證實了BATF2可以在肝癌細胞中過表達僅僅是研究的前期準備階段，下一步將更加深入的研究BATF2對肝癌增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學行為，力求闡明BATF2在肝癌中的作用及其具體機制。

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（收稿日期：2020-09-11） （本文編輯：田婧）