丁苯酞對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后B細胞淋巴瘤/白血病-2基因及其相關(guān)X蛋白表達的影響

揭育東　林冬融

【摘要】 目的：觀察丁苯酞（Butylphthalide）對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達的影響，研究在糖尿病合并急性腦卒中患者的治療中，丁苯酞所發(fā)揮的作用機制。方法：選取70只雄性SD大鼠，以簡單隨機數(shù)字法分為治療組（n=30）、對照組（n=30）及假手術(shù)組（n=10）。三組以無菌鏈脲佐菌素腹腔內(nèi)注射使實驗動物達到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組切開右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動脈后，重新縫合皮膚;治療組及對照組以栓線從右側(cè)頸內(nèi)動脈入口栓塞右側(cè)大腦中動脈實現(xiàn)大腦中動脈閉塞及再灌注。再灌注30 min后，治療組以80 mg/（kg·d）丁苯酞劑量灌胃，對照組及假手術(shù)組給予等量食用麻油灌胃，連續(xù)給藥3 d。再灌注后72 h進行神經(jīng)功能評分，最后以TUNEL法計算細胞凋亡數(shù)目，免疫組化檢測Bcl-2及Bax表達。結(jié)果：治療組神經(jīng)功能評分低于對照組（P<0.05）;治療組的凋亡細胞數(shù)少于對照組（P<0.05）;治療組的Bcl-2表達高于對照組，而Bax表達低于對照組（P<0.05）。結(jié)論：丁苯酞對糖尿病合并急性腦梗死患者腦缺血半暗帶中神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用可能是通過上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax表達而實現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】 丁苯酞 糖尿病 腦梗死 B細胞淋巴瘤/白血病-2 B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白

[Abstract] Objective： To observe the effect of Butylphthalide on the expressions of Bcl-2 and Bax with focal cerebral ischemia-reperfusion injury in diabetes rats and to study the mechanism of Butylphthalide in the treatment of diabetic patients with acute stroke. Method： A total of 70 male SD rats were selected and divided into treatment group （n=30）， control group （n=30） and sham operation group （n=10） by simple random number method. The three groups were injected intraperitoneally with sterile Streptozotocin to make the experimental animals reach the diabetic standard. In the sham operation group， the skin of the right neck was cut open and the right carotid artery was separated， then the skin was re-sutured. In the treatment group and the control group， the right middle cerebral artery occlusion and reperfusion were achieved by embolizing the right middle cerebral artery from the right internal carotid artery entrance. 30 min after reperfusion， the treatment group was given 80 mg/ （kg·d） Butylphthalide by gavage， and the control group and sham operation group were given the same amount of edible sesame oil by gavage for?3 consecutive days. Neurological function score was performed 72 h after reperfusion. Finally， TUNEL method was used to calculate the number of apoptosis cells. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2?and Bax. Result： The neurological deficit score of the treatment group was lower than that of the control group （P<0.05）; the number of apoptotic neurons in the treatment group was less than that in the control group （P<0.05）; the expression of Bcl-2 in the treatment group was higher than that in the control group， while the expression of Bax in the treatment group was lower than that in the control group （P<0.05）. Conclusion： Butylphthalide may protect diabetes rats from neurons apoptosis after focal cerebral ischemia-reperfusion by promoting the expressions of Bcl-2 and inhibiting the expressions of Bax.

[Key words] Butylphthalide Diabetes Cerebral ischemia-reperfusion Bcl-2 Bax

First-author’s address： The Fifth Affiliated （Zhuhai） Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.008

缺血性腦血管病是中老年患者常見的高致殘率、高死亡率疾病。細胞凋亡是腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損的重要一環(huán)，同時亦是糖尿病促進腦功能損害的其中一個關(guān)鍵原因[1]。丁苯酞能通過抑制細胞凋亡、促進血管內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮、促進缺血區(qū)血管新生、改善微血管結(jié)構(gòu)和功能等機制來達到保護腦神經(jīng)元的作用[2]。本研究利用動物實驗方法，探討在糖尿病合并急性腦卒中的治療中，丁苯酞所發(fā)揮的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠70只;分組：以簡單隨機數(shù)字法分為治療組（30只）、對照組（30只）、假手術(shù)組（10只）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病造模 70只實驗大鼠在實驗前14 d以正常進食進水方式飼養(yǎng)，維持體重在250～300 g。實驗前1晚禁食8 h，禁水6 h后，以左下腹腔注射5 mg/mL的無菌鏈脲佐菌素（STZ），劑量為2 mg/100 g。24 h后重復(fù)注射1次，劑量為3.5 mg/100 g。其后自由進水進食。7 d后選取非空腹血糖在16.7～25.6 mmol/L（尾尖外周血血糖）范圍內(nèi)的大鼠為造模成功的糖尿病大鼠。

1.2.2 大腦中動脈閉塞/再灌注造模 假手術(shù)組大鼠在常規(guī)備皮、消毒鋪巾后，切開右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動脈后，重新縫合皮膚，以制造假手術(shù)狀態(tài)。治療組及對照組實驗大鼠MCAO/R模型參照Zea-longa法制作，以栓線栓塞右側(cè)頸內(nèi)動脈，術(shù)后2 h將栓線外露殘端抽出退回至頸總動脈以實現(xiàn)再灌注[3]。再灌注30 min后，治療組將丁苯酞稀釋于食用麻油中，以80 mg/（kg·d）劑量灌胃，連續(xù)給藥3 d;對照組及假手術(shù)組于同樣時間給予等量食用麻油灌胃。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 所有大鼠在手術(shù)后以正常進食進水方式飼養(yǎng)，治療組及對照組于腦缺血2 h并再灌注后72 h進行評分。0、1分表現(xiàn)為大鼠四肢活動完全正常或僅左側(cè)上肢伸展欠佳，未達到造模成功標(biāo)準(zhǔn)。2分及以上表示造模成功，表現(xiàn)為大鼠左側(cè)肢體抵抗力下降、提尾行走或自行行走時僅右側(cè)肢體能活動，身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或?qū)Υ碳o反應(yīng)。造模成功的大鼠于均于再灌注后72 h取腦進行下一步實驗。以上評分均按照Bederson 6級5分制為標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2.4 凋亡細胞數(shù)檢測 采用TUNEL法，凋亡細胞的標(biāo)志為在顯微鏡下可見神經(jīng)細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。凋亡細胞的計算方法：在顯微鏡下選擇右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)缺血半暗帶區(qū)內(nèi)互不重疊的5個顯微鏡視野，計算凋亡細胞的算術(shù)平均值。

1.2.5 免疫組化檢測Bcl-2及Bax表達 Ⅰ抗分別為Bcl-2 Rabbit mAb及Bax Rabbit mAb，陽性細胞的標(biāo)志為細胞胞漿呈棕黃色。檢測方法：隨機選取缺血半暗帶區(qū)視野，以CanonD90數(shù)碼相機用統(tǒng)計焦距進行拍攝，所得圖片用MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)檢測透光度，以平均灰度級為單位，陽性率越高，則染色越深，透光率越低，其平均灰度級數(shù)值越低。取其算術(shù)平均值用于統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 治療組及對照組均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體活障礙或?qū)Υ碳o反應(yīng)等表現(xiàn)，評分均在2分及以上，其中治療組的神經(jīng)功能評分低于對照組（P<0.05）。假手術(shù)組大鼠四肢活動能力及抗阻力均正常，對刺激反應(yīng)良好，無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評分均為0分。見表1。

2.2 凋亡細胞計數(shù) 治療組及對照組大鼠的右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)缺血半暗帶中均可見數(shù)量不等的凋亡細胞，其中治療組凋亡細胞數(shù)低于對照組（P<0.05）。假手術(shù)組大鼠無腦梗死壞死病灶及缺血半暗帶，所有標(biāo)本視野中僅見極少量正常生理狀態(tài)下的凋亡細胞。見表1、圖1。

2.3 Bcl-2及Bax表達 假手術(shù)組Bcl-2及Bax表達極低。治療組及對照組均可見Bcl-2及Bax表達，并且該兩組Bcl-2及Bax表達均低于假手術(shù)組（P<0.05），其中治療組Bcl-2表達水平高于對照組，同時，治療組Bax表達水平低于對照組（P<0.05）。見表1、圖2、圖3。

3 討論

目前在我國，腦血管病已成為導(dǎo)致死亡病因的第一位，糖尿病合并急性腦梗死在中老年患者中亦為常見[5]。在合并糖尿病的腦缺血患者中，血糖的高低與缺血性腦血管病的后預(yù)后密切相關(guān)[6]。細胞凋亡是腦梗死引起神經(jīng)功能缺損的重要一環(huán)，同時亦是糖尿病促進腦功能損害的其中一個關(guān)鍵原因[1，7]。Bcl-2和Bax是一對抑制凋亡和促進凋亡的基因組，二者存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜內(nèi)，在生理及病理狀態(tài)下互相作用，共同參與細胞凋亡的過程[8]。Bcl-2和Bax鑲嵌在線粒體膜上，線粒體內(nèi)膜上同時存在著非特異性通透性轉(zhuǎn)運孔（PTP）這一結(jié)構(gòu)，在正常生理狀態(tài)下能阻止細胞色素C（Cyt C）從線粒體進入胞漿。Bax是促凋亡基因的代表，能開放PTP，使Cyt C進入胞漿，與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）的前體結(jié)合活化caspase-9，進而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3），引起細胞凋亡[9]。Bcl-2則是抑制凋亡基因的代表，其作用正好與Bax相反，其能封閉Bax形成PTP的活性，使諸如Cyt C等凋亡因子不能自由通過線粒體膜，還能通過阻止caspase活化，中斷caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而保護細胞免于凋亡[10]。實驗研究還表明，Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體對神經(jīng)細胞的凋亡起到調(diào)控作用[11]。Bcl-2/Bax的比值越大，細胞的存活率越高，反之，則存活率越低。

靜脈溶栓治療及血管內(nèi)取栓治療已成為目前公認急性缺血性腦血管病最有效的治療方法[12]，但以上兩種治療方法都有嚴格的治療時間窗和禁忌證，致使在臨床上不能廣泛應(yīng)用于大部分于急性缺血性卒中患者。國家缺血性卒中登記處的一項調(diào)查表明，只有1.6%的急性缺血性卒中患者能夠及時地接受rt-PA溶栓治療[13]。因此，臨床上急需一類沒有嚴格時間窗限制、適應(yīng)證廣、能有效保護神經(jīng)元，同時能顯著降低糖尿病患者缺血性卒中后致殘率的藥物。丁苯酞的化學(xué)全稱為消旋-3-正丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP），又名芹菜甲素，能通過促進血管內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮、促進缺血區(qū)血管新生、改善微血管結(jié)構(gòu)和功能從而增加缺血后腦灌注[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞能促進腦缺血再灌注小鼠海馬磷酸化蛋白激酶B及Bcl-2的表達，通過抑制缺血半暗帶內(nèi)線粒體釋放細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的活化，下調(diào)c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38的表達，從而抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴性凋亡通路和非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴性凋亡通路，達到阻斷凋亡過程的作用[16-17]。在臨床多中心隨機雙盲對照研究顯示，丁苯酞治療組與對照組相比，患者的肢體活動功能、語言功能等神經(jīng)系統(tǒng)功能得到顯著恢復(fù)[18]。同時，針對合并2型糖尿病的急性腦梗死患者，丁苯酞可促進神經(jīng)功能恢復(fù)、改善患者病后生活能力，經(jīng)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》推薦用于治療急性腦梗死[19-20]。

在本實驗的糖尿病大鼠中，治療組的神經(jīng)功能評分及凋亡細胞數(shù)均低于對照組（P<0.05），治療組Bcl-2表達水平高于對照組，Bax表達水平低于對照組（P<0.05）。

綜上所述，丁苯酞對糖尿病合并急性腦梗死患者腦缺血半暗帶中神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用可能是通過上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax表達而實現(xiàn)。

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（收稿日期：2021-05-31） （本文編輯：田婧）