精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響分析

陳曉文 鄭文玲 梁光林 李永強 楊文滔

摘要：目的：探討精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響。方法：選擇2019年1月至2020年12月于茂名市人民醫(yī)院生殖中心就診并進行人類輔助生殖技術（ART）治療的80例男性患者的精液標本，每份標本等分4份，以原液作為對照（A組），其他三組分別采取不同方法處理，B組采取洗滌法，C組采取上游法，D組采取密度梯度離心法，之后進行精子冷凍復蘇。比較四組精子總數、前向運動精子活率、膜完整率、DNA完整率，比較四組精子低活力與正常活力的精子冷凍復蘇率。結果：四組標本優(yōu)化前精子總數、膜完整率、DNA完整率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;復蘇后，四組精子總數均降低，C組、D組低于A組、B組，且B組、C組、D組膜完整率、DNA完整率均升高并高于A組，同時C組、D組高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。80份標本中精子低活力20份，正常活力60份。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，但C組與A組、D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;D組精子冷凍復蘇率低于A組，B組低于A組、C組、D組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：不同精液冷凍前優(yōu)化處理方式均會降低精子總數及前向運動精子活率，但可提高細胞膜完整率及DNA完整率，其中洗滌法明顯降低精子冷凍復蘇率，而上游法優(yōu)化效果好但回收率低，密度梯度離心法回收率高但優(yōu)化效果一般，應根據實際情況選擇適宜的處理方式。

關鍵詞：精液冷凍;洗滌法;上游法;密度梯度離心法;精子冷凍復蘇率;精子總數;精子活力指數

自精保存即將精子進行低溫冷凍，是人類輔助生殖技術（ART）的重要組成部分，為患者進行ART前提供了精子解決方案。考慮到男性不育患者多因為年齡、環(huán)境污染物、重金屬、致癌物、生殖系統(tǒng)疾病等因素導致精子細胞、DNA完整性受到影響，因此需對精液進行優(yōu)化處理，去除大部分非精子物質，獲得活力與形態(tài)更好的精子，利于供精人工授精（AID）和供精體外受精（IVF-D）治療[1]。洗滌法、上游法、密度梯度離心法為常用的精子優(yōu)化處理方法，各自具有一定優(yōu)勢，因此需明確不同方法對活力精子的影響，選擇最佳的優(yōu)化處理方案[2]。本研究主要探討精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響。現(xiàn)報道如下：

1資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2020年12月于茂名市人民醫(yī)院生殖中心就診并進行ART治療的80例男性患者的精液標本。按照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準進行精液篩查，符合液化正常，精液量≥2.0 ml，精子濃度為（70～200）×106/ml，正常形態(tài)≥4%標準[3]。每份標本等分4份。

1.2 研究方法

所有患者均禁欲2～7 d，在專用取精室用無菌取精杯取精，置入37℃水浴箱內液化。每份精液標本充分混勻后，分別取0.5 ml進行冷凍，將梯度離心培養(yǎng)液ART-8022按1：1體積比例添加至各組精子懸液，4℃冷凍15 min，懸掛液氮上方10 cm冷凍15 min，最后置入液氮中。冷凍前優(yōu)化處理方式如下：A組原液直接進入冷凍步驟;B組采用洗滌法，加入1 ml精子洗滌培養(yǎng)液ART-1006，離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用;C組采用上游法，緩慢加入1.2倍ART-1006，傾斜45°，置入37℃培養(yǎng)箱內孵育30 min，取上層液離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用;D組采用密度梯度離心法，無菌錐形離心管中用梯度離心培養(yǎng)液ART-2024制備密度梯度液，上層和下層分別0.5 ml 40% Isolate、0.5 ml 80% Isolate，將標本加入上層液，離心處理，去除上清液，加入ART-1006，離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用。冷凍1周后，取出置于37℃水浴箱里10 min，充分混勻后進行分析。

1.3 觀察指標

比較四組精子總數、膜完整率、DNA完整率。比較四組精子低活力（PR≤32%）與正常活力（PR>32%）的精子冷凍復蘇率（復蘇后PR精子百分率/優(yōu)化前PR精子百分率）。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS22.0版本軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 四組精子數量及形態(tài)學比較

四組標本優(yōu)化前精子總數、膜完整率、DNA完整率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;復蘇后，四組精子總數均降低，C組、D組低于A組、B組，且B組、C組、D組膜完整率、DNA完整率均升高并高于A組，同時C組、D組高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 四組精子冷凍復蘇率比較

80份標本中精子低活力20份，正常活力60份。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，但C組與A組、D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;D組精子冷凍復蘇率低于A組，B組低于A組、C組、D組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

隨著醫(yī)療技術的進步，治療不孕不育癥的方法越來越先進。近年來我國男性不育發(fā)生率逐漸提高，針對男性不育的ART受到重視，如AID和IVF-D。精液優(yōu)化處理為去除精液雜質、碎片，保證獲得高前向運動精子、細胞完整及DNA完整的精子懸液的方法[4～7]。洗滌法具有操作簡單、效率高的優(yōu)勢，但優(yōu)化效果差，基本與原液一致，甚至精子活力降低。上游法主要依據精子的活力進行優(yōu)化，精子損傷輕，優(yōu)化效果好，但耗時長，精子回收率低。密度梯度離心法可促使精液中的各種成分達到平衡，分離出正常的精子，精子損傷輕，優(yōu)化效果好，但操作中多次離心，也會對精子造成一定損傷。本研究結果顯示，復蘇后四組精子總數以A組最高，C組最低，且C組、D組膜完整率、DNA完整率顯著高于A組、B組，證實原液和洗滌法雖然可保證冷凍后足夠的精子總數，但精子細胞組膜完整率和DNA完整率降低，而上游法、密度梯度離心法可獲取活力與形態(tài)更好的精子，但精子總數降低，尤其上游法大幅降低死精子。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，而且D組精子冷凍復蘇率顯著低于A組，B組顯著低于A組、C組、D組，與梅鳳琦[8]結果“精子冷凍復蘇率由高至低排序為A組>C組>D組>B組，B組和D組精子冷凍復蘇率均顯著低于A組”相近，均證實上游法可獲得與原液基本一致的精子冷凍復蘇效果，密度梯度離心法效果相對較差，但也可保證較好的復蘇效果。洗滌法的精子冷凍復蘇效果不佳，可能與其操作中去除精漿有關，導致精子抗活性氧能力減弱，因此除非精子濃度很低，需要足夠的精子總數，否則需采取其他方法。需注意，雖然上游法、密度梯度離心法可提高復蘇后的精子活力，但上游法應用存在限制，精子總數降低過多，若為低活力且低濃度的標本，難以獲得足夠的精子總數，無法完成IUI/IVF技術[9]。

綜上所述，精液冷凍前采取上游法、密度梯度離心法可獲得較好的精子冷凍復蘇效果，提高精子細胞膜完整率及DNA完整率，應依據實際情況選擇。

參考文獻

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