精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響分析

陳曉文 鄭文玲 梁光林 李永強 楊文滔

摘要：目的：探討精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響。方法：選擇2019年1月至2020年12月于茂名市人民醫院生殖中心就診并進行人類輔助生殖技術（ART）治療的80例男性患者的精液標本，每份標本等分4份，以原液作為對照（A組），其他三組分別采取不同方法處理，B組采取洗滌法，C組采取上游法，D組采取密度梯度離心法，之后進行精子冷凍復蘇。比較四組精子總數、前向運動精子活率、膜完整率、DNA完整率，比較四組精子低活力與正常活力的精子冷凍復蘇率。結果：四組標本優化前精子總數、膜完整率、DNA完整率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;復蘇后，四組精子總數均降低，C組、D組低于A組、B組，且B組、C組、D組膜完整率、DNA完整率均升高并高于A組，同時C組、D組高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。80份標本中精子低活力20份，正常活力60份。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，但C組與A組、D組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;D組精子冷凍復蘇率低于A組，B組低于A組、C組、D組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：不同精液冷凍前優化處理方式均會降低精子總數及前向運動精子活率，但可提高細胞膜完整率及DNA完整率，其中洗滌法明顯降低精子冷凍復蘇率，而上游法優化效果好但回收率低，密度梯度離心法回收率高但優化效果一般，應根據實際情況選擇適宜的處理方式。

關鍵詞：精液冷凍;洗滌法;上游法;密度梯度離心法;精子冷凍復蘇率;精子總數;精子活力指數

自精保存即將精子進行低溫冷凍，是人類輔助生殖技術（ART）的重要組成部分，為患者進行ART前提供了精子解決方案。考慮到男性不育患者多因為年齡、環境污染物、重金屬、致癌物、生殖系統疾病等因素導致精子細胞、DNA完整性受到影響，因此需對精液進行優化處理，去除大部分非精子物質，獲得活力與形態更好的精子，利于供精人工授精（AID）和供精體外受精（IVF-D）治療[1]。洗滌法、上游法、密度梯度離心法為常用的精子優化處理方法，各自具有一定優勢，因此需明確不同方法對活力精子的影響，選擇最佳的優化處理方案[2]。本研究主要探討精液冷凍前優化處理方式對精子冷凍復蘇效果的影響。現報道如下：

1資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2020年12月于茂名市人民醫院生殖中心就診并進行ART治療的80例男性患者的精液標本。按照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準進行精液篩查，符合液化正常，精液量≥2.0 ml，精子濃度為（70～200）×106/ml，正常形態≥4%標準[3]。每份標本等分4份。

1.2 研究方法

所有患者均禁欲2～7 d，在專用取精室用無菌取精杯取精，置入37℃水浴箱內液化。每份精液標本充分混勻后，分別取0.5 ml進行冷凍，將梯度離心培養液ART-8022按1：1體積比例添加至各組精子懸液，4℃冷凍15 min，懸掛液氮上方10 cm冷凍15 min，最后置入液氮中。冷凍前優化處理方式如下：A組原液直接進入冷凍步驟;B組采用洗滌法，加入1 ml精子洗滌培養液ART-1006，離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用;C組采用上游法，緩慢加入1.2倍ART-1006，傾斜45°，置入37℃培養箱內孵育30 min，取上層液離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用;D組采用密度梯度離心法，無菌錐形離心管中用梯度離心培養液ART-2024制備密度梯度液，上層和下層分別0.5 ml 40% Isolate、0.5 ml 80% Isolate，將標本加入上層液，離心處理，去除上清液，加入ART-1006，離心處理，去除上清液，加入ART-1006重懸精子沉淀直至0.5 ml后備用。冷凍1周后，取出置于37℃水浴箱里10 min，充分混勻后進行分析。

1.3 觀察指標

比較四組精子總數、膜完整率、DNA完整率。比較四組精子低活力（PR≤32%）與正常活力（PR>32%）的精子冷凍復蘇率（復蘇后PR精子百分率/優化前PR精子百分率）。

1.4 統計學處理

使用SPSS22.0版本軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 四組精子數量及形態學比較

四組標本優化前精子總數、膜完整率、DNA完整率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;復蘇后，四組精子總數均降低，C組、D組低于A組、B組，且B組、C組、D組膜完整率、DNA完整率均升高并高于A組，同時C組、D組高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 四組精子冷凍復蘇率比較

80份標本中精子低活力20份，正常活力60份。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，但C組與A組、D組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;D組精子冷凍復蘇率低于A組，B組低于A組、C組、D組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

隨著醫療技術的進步，治療不孕不育癥的方法越來越先進。近年來我國男性不育發生率逐漸提高，針對男性不育的ART受到重視，如AID和IVF-D。精液優化處理為去除精液雜質、碎片，保證獲得高前向運動精子、細胞完整及DNA完整的精子懸液的方法[4～7]。洗滌法具有操作簡單、效率高的優勢，但優化效果差，基本與原液一致，甚至精子活力降低。上游法主要依據精子的活力進行優化，精子損傷輕，優化效果好，但耗時長，精子回收率低。密度梯度離心法可促使精液中的各種成分達到平衡，分離出正常的精子，精子損傷輕，優化效果好，但操作中多次離心，也會對精子造成一定損傷。本研究結果顯示，復蘇后四組精子總數以A組最高，C組最低，且C組、D組膜完整率、DNA完整率顯著高于A組、B組，證實原液和洗滌法雖然可保證冷凍后足夠的精子總數，但精子細胞組膜完整率和DNA完整率降低，而上游法、密度梯度離心法可獲取活力與形態更好的精子，但精子總數降低，尤其上游法大幅降低死精子。A組精子冷凍復蘇率最高，C組、D組稍低，而且D組精子冷凍復蘇率顯著低于A組，B組顯著低于A組、C組、D組，與梅鳳琦[8]結果“精子冷凍復蘇率由高至低排序為A組>C組>D組>B組，B組和D組精子冷凍復蘇率均顯著低于A組”相近，均證實上游法可獲得與原液基本一致的精子冷凍復蘇效果，密度梯度離心法效果相對較差，但也可保證較好的復蘇效果。洗滌法的精子冷凍復蘇效果不佳，可能與其操作中去除精漿有關，導致精子抗活性氧能力減弱，因此除非精子濃度很低，需要足夠的精子總數，否則需采取其他方法。需注意，雖然上游法、密度梯度離心法可提高復蘇后的精子活力，但上游法應用存在限制，精子總數降低過多，若為低活力且低濃度的標本，難以獲得足夠的精子總數，無法完成IUI/IVF技術[9]。

綜上所述，精液冷凍前采取上游法、密度梯度離心法可獲得較好的精子冷凍復蘇效果，提高精子細胞膜完整率及DNA完整率，應依據實際情況選擇。

參考文獻

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[9]歐展輝，陳志恒，王慧，等.不同的精液處理方法對體外受精IVF周期結局的影響[J].中國優生與遺傳雜志，2017，25（10）：120-121.