MUC5B、MUC6在骨肉瘤中的表達及意義

陳云 王金山 王云飛 張大鵬

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨的原發性腫瘤，主要起源于間葉組織，惡性程度極強，好發于血運豐富的長骨干骺端，在12～20歲青少年中發病率最高[1,2]。臨床上多見脛骨近端和股骨遠端，易復發和轉移，患者致殘致死率極高，一般患者生存率在70%左右且預后極差[3]。因此，探究骨肉瘤相關的生物分子標志物，對骨肉瘤早期發現，患者的生存與預后極為重要。黏蛋白(mucin，MUC)主要由體內多種上皮細胞分泌而來，根據結構可分為分泌型和膜結合型，生理功能包括防護外來異物、識別和保護細胞、粘性維持等[4]。研究表明MUC與多種癌癥的發生和發展緊密相關，在腫瘤組織中常呈異常表達[5,6]。MUC5B和MUC6同屬MUC一族，均為分泌型，由不同的黏蛋白基因編碼而成，具有不同特定功能。研究發現，在鼻咽癌變過程中，長期的炎癥刺激導致黏膜上皮細胞增殖、轉化，促使MUC5B高表達，從而保護上皮組織[7]。MUC6一般表達在表面小凹上皮細胞、胃竇深部腺體、黏液腺頸細胞和幽門腺細胞，屬于胃腸型免疫標志物[8]。近幾年，MUC5B和MUC6在其他腫瘤組織表達情況逐漸成為研究熱點，而筆者發現在骨肉瘤組織中表達水平研究較少。本研究擬采用免疫組化法測定骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6的表達水平，探討二者與骨肉瘤患者臨床病理特征及預后的關系，以期為骨肉瘤的臨床診治和預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014年4月至2017年4月經手術切除的骨肉瘤標本67例，其中男41例，女26例；年齡10.12～61.47歲，平均年齡(30.64±3.79)歲；腫瘤部位為肱骨、脛骨和股骨；直徑4.12～17.35 cm，平均直徑(10.91±0.85)cm。組織學分類按照Dahlin標準，骨母和軟骨細胞型29例，纖維母細胞型38例。組織學分級按照Price標準，Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ期24例。另取骨纖維異常增殖73例和正常組織標本87例。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)受試者及家屬對本研究知情，并簽訂協議書；(2)受試者在術前未曾接受放療或化療等抗腫瘤治療且無手術禁忌；(3)患者經病理診斷確診為骨肉瘤。排除標準：(1)受試者患有心臟病、肝病、高血壓等疾病；(2)受試者資料不完整，無法進行術后隨訪。

1.3 實驗試劑 鼠源人抗MUC5B、MUC6購自上海信裕生物科技有限公司；免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，通用型二抗購自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.4 實驗方法 采用免疫組化法進行操作：將石蠟包埋的組織進行切片(厚度3～5 μm)，每個組織切6片，烘干(60℃，2 h)，烘干后經二甲苯脫蠟，依次用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度洗脫脫水、行抗原修復，其中3片滴加鼠抗人MUC5B單克隆抗體，剩余3片滴加鼠抗人MUC6單克隆抗體，25℃孵2 h。之后PBS沖洗3次，滴加通用型二抗，25℃孵育24 h，用DAB 顯色和蘇木素復染，最后用中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察拍照。用已知陽性的病理切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.5 結果判定 實驗結果采用半定量法進行描述，即通過所取樣品的陽性染色強度和陽性細胞所占百分比來共同判定。每個實驗結果由3位專業人員獨立判斷評定，具體評分標準如下，MUC5B陽性表達為細胞漿中出現棕黃色至深棕色顆粒，MUC6陽性表達為細胞質或細胞膜中出現棕黃色顆粒。陽性強度評分：樣品無染色0分，樣品呈淺黃色1分，樣品為黃色2分，樣品為棕黃色3分。在顯微鏡下，每張切片任意選擇3個高倍視野，按照陽性細胞所占百分比評分，評分標準：0分(陽性細胞所占比例<10%)，1分(陽性細胞所占比例10%～30%)，2分(陽性細胞所占比例30%～60%)，3分(陽性細胞所占比例>60%)。根據染色指數(staining index,SI)(即染色強度與陽性細胞所占比例的評分乘積)大小將免疫組化結果進行等級劃分：0～1分表示為陰性(-)，2～3分表示為弱陽性(+)，4～6分表示中度陽性(++)，7～9分表示強陽性(+++)。其中陰性和弱陽性表示低表達，中度陽性和強陽性表示高表達。

1.6 隨訪 所有骨肉瘤患者治療后均接受常規隨訪，隨訪時間12～48個月，本次隨訪截止日期2018年4月30日，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時間，本次隨訪中位時間26.08個月。觀察并記錄骨肉瘤患者在隨訪期間復發和生存情況。

2 結果

2.1 MUC5A和MUC6在各類骨組織上的表達水平 MUC5B在骨肉瘤組織中陽性表達呈現為彌漫性細胞漿染色，MUC6陽性表達呈現為細胞質/細胞膜染色。骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6陽性表達率分別為79.10%(53/67)和71.46%(48/67)，均顯著高于正常組織組、骨纖維異常增殖組，差異有統計學意義(P<0.05)。正常組織組與骨纖維異常增殖組骨肉瘤組織中MUC5B和MUC6陽性表達率相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各類骨組織MUC5B和MUC6的表達水平 例(%)

2.2 MUC5B和MUC6水平與骨肉瘤臨床病理指標的關系 MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小、Dahlin分類、Price分級無相關性(P>0.05)，與腫瘤的組織分化程度、有無肺轉移、臨床分期顯著相關(P<0.05)。見表2。

表2 MUC5B和MUC6水平與骨肉瘤臨床病理指標的關系 例(%)

2.3 MUC5B和MUC6表達水平與骨肉瘤患者生存率的關系 MUC5B高表達骨肉瘤患者中位生存時間為17.76個月，顯著短于MUC5B低表達患者中位生存時間(35.77個月)(P<0.05)。MUC6高表達骨肉瘤患者中位生存時間為19.07個月，顯著短于MUC6低表達患者(35.70個月)(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 MUC5B表達水平與骨肉瘤患者生存率關系

2.4 影響骨肉瘤患者預后的危險因素 單因素分析表明，有肺轉移、高中組織分化、MUC5B高表達、MUC6高表達均是影響骨肉瘤患者不良預后的危險因素。多因素分析表明，有肺轉移、MUC5B高表達、MUC6高表達是影響骨肉瘤患者不良預后的獨立危險因素(HR=1.465，95%CI為1.033～2.079；HR=2.378，95%CI為1.889～2.993；HE=2.101，95%CI為1.638～2.694，P均<0.05)。見表3。

圖2 MUC6表達水平與骨肉瘤患者生存率關系

3 討論

目前骨肉瘤的病因尚不清楚，普遍認為可能與病毒感染、遺傳因素、放射線損傷等有關。骨肉瘤臨床主要表現為疼痛(常由間接性發展成連續性)和局部軟組織腫塊，早期病患處皮膚發亮，晚期呈現淺表靜脈充盈[9]。由于臨床癥狀不明顯，易出現誤診現象，大多數患者在確診時已有微小轉移灶存在，錯過最佳治療時期。因此研究與骨肉瘤發生發展有關的生物標志因子已成為當前研究的熱點。

近幾年MUC在腫瘤組織異常表達情況成為研究熱點，在胃癌、乳腺癌、結直腸癌等有研究報道，隨著臨床研究的發展，MUC有望為腫瘤早期診斷和預后提供判斷依據[10]。MUC5B和MUC6在其他癌癥中的表達水平已被廣泛研究報道。王平凡等[11]研究表明MUC5B在腸上皮化生和幽門腺的陽性表達率顯著高于膽囊腺癌，推測致癌因素長期刺激引起MUC5B表達下調，黏蛋白對機體保護作用減弱，導致膽囊腺發生癌變。王云檢等[12]研究表明MUC5B在膽囊結石組織中表達水平顯著高于膽囊息肉組和對照組，分析可能是一些誘導因子會促進MUC5B高表達，從而導致粘液分泌量和粘度增加，導致枸櫞酸鈉或其它鈣鹽的沉積，促進膽囊結石的發生。鄭瑞等[13]研究表明在不同Siewert分型的早期胃癌患者體內MUC6表達水平有顯著差異，并與早期胃癌的組織學分型、腫瘤大小、浸潤程度、萎縮情況和腸化生顯著相關。陳思敏等[14,15]研究表明在胰腺導管內管狀乳頭狀腫瘤伴浸潤性癌(IPTN)組織中高表達，提示MUC6有助于臨床病理診斷IPTN。

表3 影響骨肉瘤患者預后的危險因素分析

本研究采用免疫組化法測定MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中表達水平，結果表明陽性表達率分別為68.70%(46/67)和71.46%(48/67)，顯著高于正常組織組和骨纖維異常增殖組，提示MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中異常高表達，與骨肉瘤有相關性。本研究還發現，MUC5B和MUC6在骨肉瘤組織中的表達水平與腫瘤的組織分化程度、有無肺轉移有關，提示MUC5B和MUC6可能參與骨肉瘤的發生發展過程。進一步分析發現，MUC5B高表達、MUC6高表達骨肉瘤患者中位生存時間分別顯著短于MUC5B低表達、MUC6低表達患者，提示MUC5B高表達、MUC6高表達骨肉瘤患者預后情況較差。最后本研究采用COX多因素分析發現，有肺轉移、MUC5B高表達、MUC6高表達是影響骨肉瘤患者不良預后的獨立危險因素，提示MUC5B和MUC6可能作為判斷骨肉瘤預后的臨床指標。

綜上所述，MUC5B和MUC6在骨肉瘤患者癌組織中表達水平顯著升高，與骨肉瘤的組織分化程度、有無肺轉移及生存情況有關，有望成為骨肉瘤預后的檢測指標，但是二者參與骨肉瘤發生發展的機制有待進一步研究。