實時熒光定量PCR法與常規細菌鑒定法在腸道致病菌檢測中的應用效果對比分析

高 穎

（朝陽市疾病預防控制中心微生物檢驗所，遼寧 朝陽 122300）

臨床中發病率較高的消化系統疾病之一即為腹瀉，臨床表現為排便次數增多且大便性狀改變，可分為急性腹瀉與慢性腹瀉兩種，急性腹瀉的致病原因包括感染、中毒、藥物及其他疾病，慢性腹瀉致病原因則為腸道疾病（感染及非感染性）、腫瘤、小腸吸收障礙、腸動力異常、全身疾病及肝膽等組織器官疾病[1]。與其他類型腹瀉相比，感染性腹瀉的流行性較為廣泛，主要致病菌包括沙門菌與志賀菌兩類[2]。對感染性腹瀉予以治療前，首先需確定致病菌類型，才能準確用藥，使治療及預后效果得以提高。對腹瀉致病菌予以檢測的傳統方法為常規細菌鑒定法，雖然有較高的檢出率，但操作步驟繁瑣及檢驗期較長，不具有靈敏度，同時易受外界其他因素的影響[3]。隨著醫療技術的不斷進步和發展，臨床對于腸道致病菌的檢測多應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）法，該方法對死細菌及活細菌均有較高的檢出率，且操作簡便。本文對實時熒光定量PCR法與常規細菌鑒定法在腸道致病菌檢測中的應用價值予以分析。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年9月至2019年10月收治的360例腹瀉患者為研究對象，并對以上患者的糞便標本予以采集。

1.2 方法 對所有患者糞便標本均實施常規細菌鑒定法及實時熒光定量PCR法檢測。

常規細菌鑒定法：在肛拭子中應用采樣器予以采取及增菌，采樣器必須為一次性，增菌時長為18～24 h，增菌方法為于增菌液（志賀菌及沙門菌）中置入肛拭子。然后于XLD及SS瓊脂中用劃線法接種，并在37 ℃環境中培養樣本于平板培養基中，對菌落變化進行觀察及記錄；其次需對可疑菌落進行選取，并實施涂片和染色處理，將其放置在顯微鏡下進行觀看及檢測；另對可疑菌落予以選取，在經涂片和染色處理后，實施氧化酶試驗及觸酶試驗，若有必要，還可將血清學凝聚試驗應用于以上標本中，確保妥善完成鑒定工作[4]。最后應用單價血清凝聚法及多價血清凝聚法判定取自于雙糖內的細菌懸液。

實時熒光定量PCR法：實施3～5 h的增菌于肛拭子中，增菌液中需含有志賀菌及沙門菌，在1.5 mL無菌離心管中加入2滴增菌液，轉移液體滴管需為一次性，然后再將20人份肛拭子增菌液加入以上試管中，進行3 min左右10000 r/min轉速的離心處理，將上清液予以最大限度移除，對50 μL底層液進行檢測。將DNA提取液共5 μL加入底層液中并進行觀察，直到沉淀懸浮現象出現后進行5 min左右100 ℃煮沸，再予以3 min 10000 r/min轉速的離心，于干凈滅菌離心管中置入離心所得5 μL上清液[5]。使用25 μL反應體系，將志賀菌VIC及沙門菌FAM作為檢測通道，實施擴增后進行一個94 ℃/3 min循環檢測，再進行40個93 ℃/30 s～55 ℃/45 s的循環檢測。

1.3 統計學分析 將研究所得數據進行歸納整理，并將計數資料以[n（%）]的形式錄入SPSS 25.0統計學軟件中，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

360份糞便標本中，常規細菌鑒定法檢測出沙門菌14株，志賀菌6株，檢測陽性率分別為3.89%及1.67%。實時熒光定量PCR法檢測出沙門菌15株，志賀菌6株，檢測陽性率分別為4.17%及1.67%。兩種檢測方法對沙門菌及志賀菌的檢測陽性率比較，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。將實時熒光定量PCR法檢測陽性患者的糞便標本再行常規細菌鑒定法檢測，陽性率為100.00%。

3 討 論

腹瀉是一種常見且多發的疾病，可發生于任何年齡段的人群，患者臨床表現為大便次數增多及大便稀溏等癥狀[6]。感染性腹瀉的常見致病菌為志賀菌及沙門菌，傳播途徑包括消化道、飲用或進食受污染的水源或食品，使患者生活質量及身體健康受到不利影響[7-8]。對于感染性胃腸道疾病，臨床通常給予抗生素治療，考慮到抗生素應用的合理性，需在制訂治療方案前準確判斷致病菌，并進行針對性給藥，可以縮短治療時間，改善患者癥狀及疾病預后效果[9]。

常規細菌鑒定法為鑒定志賀菌及沙門菌的常用方法，檢測環節包括3項，首先接種培養菌株，再行生化鑒定，最后對血清學予以檢測，檢測操作較為繁瑣及檢測試劑使用較多，因此檢測用時相對較長，檢測人員必須具有較高的檢測技術及操作水平[10]。除此之外，常規細菌鑒定法的靈敏度不高，若受到以下因素影響，可能會降低檢測的準確性：①因為該方法具有繁瑣復雜的流程，在操作過程中若取菌環未降溫，沾取的標本無較多菌落數量[11]；對志賀菌或沙門菌無法進行準確辨別，都有可能造成檢測結果誤差，提高漏診及誤診發生率[12]。②若在實施檢測之前，患者應用廣譜抗菌類藥物，那么則會使檢測靈敏度降低。③若有干擾物質或雜菌存在于被檢測樣品中，則有可能降低檢測成功率。除此之外，檢測時間、樣本數量以及培養條件等客觀因素都會對細菌鑒定結果造成影響，再加上檢測時間較長，致使該方法的應用效果較差。醫療技術及社會的不斷進步使得分子生物學技術被廣泛應用于醫療事業中，作為此類技術中用于鑒別腸道致病菌的方法，實時熒光定量PCR法可以彌補常規細菌鑒定法的缺陷，因為該方法檢測的主要內容為細菌DNA，除可用于鑒別致病菌外，還能夠對細菌性腹瀉予以追蹤。實時熒光定量PCR法雖然具有較高的靈敏度及檢出率，但是需使用較為昂貴的試劑盒及離心管，為節約成本，可將上機樣品設置為20人份，用于平攤檢測費用，并且不會影響鑒定結果。

本次研究結果顯示，360份糞便標本中，常規細菌鑒定法檢測出沙門菌14株，志賀菌6株，檢測陽性率分別為3.89%及1.67%；實時熒光定量PCR法檢測出沙門菌15株，志賀菌6株，檢測陽性率分別為4.17%及1.67%。兩種檢測方法對沙門菌及志賀菌的檢測陽性率比較，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。將實時熒光定量PCR法檢測陽性患者的糞便標本再行常規細菌鑒定法檢測，陽性率為100.00%。

綜上所述，在腸道致病菌的檢測中，可應用實時熒光定量PCR法，該方法能夠在提高檢出率的同時，縮短檢測時間。