多囊卵巢綜合征顆粒細胞線粒體功能障礙的研究進展

宋琳奕，俞瑾，俞超芹*

1中國科學院大學寧波華美醫院中醫科，浙江寧波 315000；2海軍軍醫大學第一附屬醫院中醫婦科，上海 200433

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性常見的內分泌、代謝紊亂性疾病，其對生殖力的影響貫穿于整個生育期[1]，臨床上主要表現為卵泡發育異常、排卵障礙及流產等[2-3]，根據不同的人群及診斷標準，其患病率為5%～15%[4]。PCOS是無排卵性不孕的最常見病因，占無排卵性不孕的70%[5]。PCOS患者的卵泡發育障礙主要表現為竇前卵泡過多、竇狀卵泡生長障礙及卵泡閉鎖等。患者雙側卵巢雖有大量竇卵泡，但不能周期性形成優勢的成熟卵泡是導致不孕的重要原因。同時，PCOS患者行體外受精移植(in-vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)時，雖然獲卵數目明顯增加，但卵母細胞質量通常不佳，從而導致移植周期取消率高及受精率低[6]。

全基因組關聯分析(genome wide association study，GWAS)及對核基因組進行的其他研究未能為PCOS發病的精確機制提供相關線索，而越來越多的研究發現，線粒體功能障礙可能是卵泡發育障礙的重要原因之一[7-8]。本文對近年來PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的相關研究進展進行綜述，以探討PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的發生機制及其改善途徑和方法。

1 線粒體功能與卵泡發育

線粒體是重要的細胞器之一，含量較為豐富，是細胞代謝的重要場所。線粒體由內膜、外膜、膜間隙及基質等構成。其中，線粒體內膜深度內陷形成線粒體嵴，為線粒體中各種呼吸鏈復合物及各種脂類合成代謝相關酶提供附著位點及反應場所。線粒體在決定生殖過程的眾多因素中起關鍵作用，如卵母細胞質量、卵泡生長發育和顆粒細胞增殖等[9]。線粒體還介導多種細胞過程，包括細胞凋亡、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)調控、鈣信號傳導，以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、嘧啶、鐵硫蛋白(iron sulfur proteins，Fe-S)的合成等[10]。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是獨立于細胞核之外的遺傳物質，可以完整地傳達遺傳信息。mtDNA是一種具有16 569個堿基對的閉合雙鏈環狀分子，編碼22個轉運RNA(tRNA)，以及獨立的D-loop區，兩個核糖體RNA(rRNA，12S和16S)和13個氧化磷酸化蛋白亞單位。mtDNA損傷或突變都可能誘導線粒體功能障礙，從而影響能量的產生以及組織、器官的功能[11]。

線粒體是卵母細胞質中含量最為豐富的細胞器，幾乎提供了卵母細胞生命活動中的全部能量。線粒體是胚胎內數量最多的母系嫡傳細胞器，胚胎中的線粒體全部來自于卵母細胞，卵子內線粒體的數量及功能與胚胎質量密切相關[12]。

線粒體在顆粒細胞中的含量也非常豐富，參與了顆粒細胞的細胞周期、代謝及信號轉導等方面的調節[13]。顆粒細胞線粒體可通過能量代謝途徑為卵母細胞減數分裂、受精直至早期胚胎發育提供能量支持[14]，也為甾體激素如孕酮、雄激素、雌激素等的合成提供能量支撐[15]。線粒體發生異常可影響細胞的正常功能，甚至誘導細胞死亡。有學者對3名婦女凍存的卵巢組織原始卵泡和初級卵泡中的顆粒細胞轉錄組進行類比研究發現，在來自原始卵泡的顆粒細胞中，包括編碼自由基清除劑過氧化物還原酶5(PRDX5)及硫氧化還原蛋白2(TXN2)等在內的30個基因與線粒體功能障礙相關，提示原始卵泡顆粒細胞發育過程中有大量的能量產生和自由基清除，其線粒體功能障礙將影響原始卵泡的進一步發育，推測這可能是PCOS形成的潛在機制之一[16]。

2 卵巢顆粒細胞與卵泡發育

卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞是卵泡的主要組成部分。卵泡發育是一個復雜的生理過程，顆粒細胞的生長分化是其重要標志。生長期卵泡的發育及卵泡閉鎖是通過受體介導途徑調控的，顆粒細胞自分泌及旁分泌的物質可促進顆粒細胞增殖及卵泡生長[17]，同時顆粒細胞與膜細胞的相互作用是卵泡發育和維持正常功能的重要條件，因此，顆粒細胞在原始卵泡的啟動和生長發育中起著重要的調控作用[18]，顆粒細胞代謝、生長分化及凋亡率的改變與卵泡發育成熟或閉鎖息息相關，甚至可能影響胚胎的質量及最終的受孕結果[19]。有研究發現，顆粒細胞線粒體質量下降，及其結構、功能和mtDNA拷貝數量異常是卵泡發育障礙的重要原因之一[20-21]。

3 卵巢顆粒細胞線粒體功能與卵母細胞質量

目前，在生殖醫學中，多基于胚胎形態(如形態計量及形態分析等)及反映胚胎活力的發育動力學指標評估卵母細胞質量[22]。然而，上述評估標準的信息量非常有限，且很難在不改變其完整性的情況下進行研究，操作上仍存在局限性[23]，因此，目前研究者正試圖探索其他可靠的、非侵入性的可提示胚胎功能的生物標志物[24]。

研究卵母細胞周圍的微環境如壁層顆粒細胞、卵丘細胞、卵泡液，以及其與臨床參數的相關性具有重要意義[25]。人類在胎兒期就已形成始基卵泡儲備，顆粒細胞自始基卵泡時期就圍繞在卵母細胞周圍，與卵母細胞處于同一卵泡環境中，兩者之間通過緊密接觸和縫隙連接進行物質交換及信息溝通，因而研究顆粒細胞的功能可以反映卵母細胞的發育和質量[26-27]。卵母細胞在氧化磷酸化過程中合成ATP的底物丙酮酸鹽即是由顆粒細胞提供的。丙酮酸鹽是顆粒細胞葡萄糖糖酵解過程中產生的中間代謝物。由于顆粒細胞相對容易獲取，且可間接反映卵母細胞質量，因此，著眼于卵巢顆粒細胞的研究被認為是評價卵母細胞質量和胚胎發育潛力的最佳無創性方法之一[28-29]。

顆粒細胞線粒體作為能量代謝途徑的關鍵因素，直接參與了卵泡發生過程中卵母細胞功能的建立[13]。因此，線粒體功能對于顆粒細胞的能量生產，進而作為卵母細胞成熟的能量來源是至關重要的。將顆粒細胞線粒體作為評估卵母細胞質量的指標有一定的可行性及可操作性[30]。

研究表明，PCOS患者卵母細胞有低糖酵解活性，并優先攝取顆粒細胞提供的能量底物來維持能量平衡[31]。顆粒細胞功能失調可導致嚴重的細胞損傷，影響卵母細胞成熟，最終使PCOS患者生成異常卵泡[32-33]及卵母細胞核成熟和受精率下降[34]。因此，顆粒細胞對維持卵母細胞的穩態至關重要。有研究指出，在PCOS患者的卵泡發生過程中，卵母細胞從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉化紊亂可歸因于顆粒細胞的線粒體功能障礙[32]。

4 PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的發生機制

4.1mtDNA拷貝數改變 PCOS患者mtDNA拷貝數異常及線粒體基因突變一直是研究的重點，而功能性線粒體疾病已逐漸被視為PCOS發病的相關因素[35]。

mtDNA拷貝數是衡量線粒體數量的相對指標。維持mtDNA拷貝數對于保持線粒體功能和細胞生長至關重要[36]。在卵母細胞成熟過程中，mtDNA不斷復制，發育至成熟卵母細胞時其拷貝數已增加30倍以上[37]，通常包含至少1×105個mtDNA拷貝，這是正常卵泡發育和成熟所必需的[38]。

Wang等[39-40]研究糖尿病小鼠間接提示了周圍顆粒細胞mtDNA與卵母細胞具有相關性；同樣的結果也在豬模型的研究中得到驗證[41-42]。在對人類的研究中已證實顆粒細胞mtDNA含量與相應卵母細胞的mtDNA含量、胚胎質量之間存在相關性，提示顆粒細胞可能通過提高卵母細胞質量，改善卵泡發育，從而支持足夠的胚胎發育[43-44]。mtDNA拷貝數可評估卵母細胞和胚胎發育的潛能[45-46]。

線粒體拷貝數目前多采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)進行檢測，后者是一種敏感且較為成熟的檢驗技術[47-48]。Reddy等[33]發現在PCOS女性中mtDNA拷貝數明顯減少。而mtDNA拷貝數減少可導致mtDNA編碼基因的線粒體功能障礙，使ROS生成增加及PCOS進一步發展[3,49]。Lewis等[50]發現，PCOS患者的mtDNA拷貝數較正常女性低，且mtDNA拷貝數與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)水平、腰圍和三酰甘油水平呈負相關，與性激素結合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)水平呈正相關。Ogino等[51]通過檢測卵丘顆粒細胞mtDNA拷貝數對體外受精過程中的胚胎質量進行預測，其陽性預測值和陰性預測值分別為84.4%和82.1%，因此提出顆粒細胞mtDNA可作為預測胚胎存活率的生物標志物。

4.2mtDNA突變 mtDNA較核DNA(nucleus deoxyribonucleic acid，nDNA)更容易受到氧化損傷，并存在更高的突變率，可能的原因包括mtDNA的表達、維持、拷貝數調節及修復過程依賴于核基因組[52]，缺乏自身保護組蛋白，缺乏有效的DNA修復能力，以及與電子呼吸鏈關系密切而接觸到了更多的氧自由基等[33]。

線粒體轉運RNA(mitochondrial transfer RNA，mt-tRNA)的突變破壞了mtDNA的結構和功能，影響了mt-tRNA的穩態水平和氨基酰化能力，可能導致線粒體蛋白質合成缺陷，從而抑制呼吸鏈功能，并導致ATP合成減少和ROS生成增加[53]，可能與PCOS患者線粒體功能障礙的發生機制有關。Goto等[54]在PCOS患者外周血中發現mt-tRNA基因、12S和16S rRNA基因存在變異，這些突變出現在高度保守的tRNA核苷酸中，因此提出mtDNA編碼mttRNA的基因點突變可能與疾病的發展有關。Ding等[55]對中國一個有遺傳性IR的漢族家系進行了研究觀察，對其線粒體進行基因組序列分析，此家族中第三代為PCOS患者，全線粒體基因組序列分析結果顯示，在tRNALeu(UUR)基因的受體臂中存在同源A3302G，此突變破壞了高度保守的堿基配對(2T-71A)。隨后該團隊繼續對該家系進行線粒體基因組序列分析，發現存在同質ND5 T12338C和tRNASer (UCN) C7492T突變，其中同源C7492T突變發生在tRNASer(UCN)編碼基因的反密碼子干26位[56]，影響了tRNA的穩態水平和氨基酰化能力；之后再通過對80例PCOS合并IR女性患者與健康對照組進行mt-tRNA突變檢測，篩選出可能與PCOS合并IR相關的9個mt-tRNA突變，提出這些突變改變了mt-tRNA的二級結構，從而導致mt-tRNA功能障礙[57]。Ding等[58]發現，PCOS患者存在線粒體基因tRNALeu中的C3275T突變，tRNAGln的反密碼子干中的T4363C突變，以及tRNALys的A8343G突變；生化分析結果顯示，這些mt-tRNA突變患者的線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平、ATP產量及mtDNA拷貝數均降低，但ROS生成增加，提示這些突變可能導致線粒體功能障礙，進而出現相應的臨床表現。Saeed等[49]對PCOS患者的mt-tRNA進行測序并與修正劍橋序列進行比對，證實了上述觀點，且新發現了mt-tRNALeu(UUR)基因不同類型的突變。

mtDNA D-loop區是線粒體基因組中唯一的非編碼區，包含了mtDNA重鏈和輕鏈復制的起點和啟動子；該區域突變可通過改變mtDNA的復制和轉錄，而使線粒體功能發生障礙[59]。Reddy等[33]對南印度PCOS患者與對照組的線粒體D-loop進行測序，發現D310及A189G單核苷酸多態性(SNPs)與PCOS之間存在明顯的相關性，攜帶D310和A189G等位基因的PCOS患者mtDNA拷貝數明顯低于非攜帶者。

這些結果表明，PCOS的臨床表型可能與上述突變引起的線粒體功能障礙有關，但要進一步探討mt-tRNA異常的臨床意義，闡明mt-tRNA突變與PCOS之間的關系，仍需進行多種族和多中心的深入研究。

5 改善PCOS顆粒細胞線粒體功能的方法

已有團隊在此方面進行了嘗試和探索。Safaei等[60]對脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)誘導培養的PCOS小鼠顆粒細胞研究發現，采用維生素D3治療的PCOS小鼠中，線粒體生物起源基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α)、核呼吸因子(nuclearrespiratoryfactors，NRFs)、抗氧化劑基因超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、過氧化氫酶(CAT)及抗凋亡基因Bcl-2表達上調，同時ROS水平降低，提示維生素D3可能通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路來改善線粒體的生物起源基因。此外，該團隊還發現，經維生素D3處理的PCOS小鼠顆粒細胞mtDNA拷貝數明顯高于未經處理的PCOS顆粒細胞，提示維生素D3可能通過促進PCOS小鼠顆粒細胞線粒體生物合成及細胞膜完整性，增加mtDNA拷貝數，從而改善卵泡發育，進而提高卵母細胞的質量[61]。

Salehi等[62]對二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)誘導培養的PCOS大鼠顆粒細胞進行研究發現，DHT誘導的顆粒細胞動力蛋白相關蛋白1(Drp1)表達上調與PCOS大鼠顆粒細胞線粒體過度裂變、巨自噬及細胞凋亡有關，而外源性促性腺激素可誘導線粒體融合并減輕顆粒細胞的凋亡。

中醫藥是中華民族的瑰寶，中藥可通過多途徑、多靶點緩解PCOS患者的臨床癥狀，改善卵巢內環境，促進卵泡生長發育，誘發排卵。蒼附導痰湯可通過抑制miR-29a靶向結合PGC-1α的3'端非翻譯區(3'-UTR)，促進PGC-1α及其下游的核呼吸因子-1抗原(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)、雌激素受體相關受體α(estrogen-related receptor α，ERRα)的mRNA表達，從而促進線粒體生物合成、葡萄糖利用、脂肪酸氧化，并改善PCOS-IR大鼠卵巢顆粒細胞的IR狀態[63]。

6 總結與展望

綜上所述，PCOS患者存在線粒體功能障礙及基因表達異常，而線粒體在生殖細胞中含量豐富，且相對容易獲取，故研究顆粒細胞的線粒體功能是探討PCOS的病理機制、評價卵母細胞質量和胚胎發育潛力的最佳無創性方法之一。然而，在PCOS患者顆粒細胞線粒體功能障礙的具體機制、與臨床表型之間的關系，以及篩選評估預后的特異性指標等方面，目前尚缺乏系統研究，仍有待進一步探索。

在治療方面，線粒體替代或線粒體補充療法用于臨床改善PCOS的卵母細胞及胚胎質量是否可行，因倫理爭議和異質性風險無法開展。目前，我們可以發揮中醫藥的優勢，采用現代藥理學研究方法，探討中藥對PCOS顆粒細胞線粒體功能的調節作用，這對PCOS的治療具有重要的指導意義，也是中醫藥走向現代化的探索之路。