SARS-CoV-2的宿主組織分布和體液中排放研究進展

張擁軍,凌 華,陳愛平

作為第7種能夠感染人類的冠狀病毒,SARSCo V-2引起的2019年冠狀病毒病(COVID-19)全球大流行已經持續了1年多時間。這場前所未有的疫情傳播速度快,波及范圍廣,給全球經濟、社會帶來巨大的影響,迄今已經有確認超過1.1億人感染,超過252萬人喪生[1]。盡管采取了各種非藥物干預的公共衛生措施,并且已經有多個疫苗緊急獲得批準,在數十個國家先后開展大規模預防接種,目前新增感染人數仍然高居不下,全球疫情防控形勢十分嚴峻。

在過去的一年多里,隨著疫情規模的不斷擴大,經過全球各相關領域的科學家共同努力,不同學科對于這個全新疾病的認識不斷在積累更新。雖然SARS-Co V-2與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-Co V)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERSCo V)同屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)β冠狀病毒屬(Betacoronavirus),其基因組結構存在較大的差異,與SARS-Co V、MERS-Co V基因組的相似度分別約為80%、50%[2]。這3種病毒都能夠引起嚴重呼吸系統疾病,其動物宿主、流行病學、臨床表現等方面已經證實存在差異[3]。本文從病原學角度,通過總結SARS-Co V-2的細胞受體在人體不同組織的分布和被感染患者不同器官的臨床癥狀,根據國內外COVID-19尸檢報告分析病毒的人體細胞嗜性,并根據各種體液樣品的檢測結果描述病毒在不同體液中持續排放特征。以促進深入理解SARSCo V-2致病機制,推動感染防控措施,加強感染者管理和治療,促進科學防控COVID-19全球大流行疫情。

1 SARS-CoV-2病毒受體在人體組織中的分布

不同的病毒感染各種宿主細胞都需要特定的病毒受體,這類受體在不同細胞表面的表達和分布決定了病毒的組織嗜性。在確認了SARS-Co V-2是導致COVID-19的病原之后,研究人員隨即證實血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和跨膜絲氨酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2,TMPRSS2)參與了SARS-Co V-2感染過程[4-6]。其中,ACE2作為病毒進入細胞的表面受體,TMPRSS2則裂解和激活病毒刺突蛋白S。因此,明確ACE2受體和TMPRSS2在人體組織中的分布、表達和活性有助于理解SARS-Co V-2潛在感染人體的途徑和致病機制。

經過不同團隊證明,ACE2受體在以下組織表達,包括呼吸道上皮(氣管和支氣管上皮細胞、2型肺泡細胞)、心血管系統(冠狀動脈內皮細胞、心肌細胞、心外膜脂肪細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞)、胃腸道(食管角質細胞、胃腸道上皮細胞、腸上皮細胞、十二指腸、小腸、直腸)、泌尿生殖系統(近端腎小管、膀胱尿道上皮細胞、睪丸、精囊)以及肝臟、膽囊和神經系統。但脾、甲狀腺、淋巴結、骨髓和部分免疫系統細胞無ACE2受體[4-6]。

根據人類蛋白圖譜(Human Protein Atlas,HPA)數據庫中RNA和蛋白表達數據,TMPRSS2主要在肺、唾液腺、甲狀腺、胃腸道、胰腺、腎、肝細胞中表達。在多種男性組織如輸精管、儲精囊、前列腺中,TMPRSS2也有較低水平表達,但在睪丸細胞及所有女性組織(乳房、卵巢、輸卵管、子宮、胎盤)中無TMPRSS2表達,TMPRSS2的組織分布可能與SARS-Co V-2在男性的高感染率和嚴重程度中發揮作用[4-6]。

值得注意的是,目前有研究表明,ACE2在人體多種組織存在不同水平的表達,而且在口腔、胃腸道和男性生殖系統表達最高,但該受體表達水平并不與病毒檢測結果相對應,表明SARS-Co V-2的致病機制還涉及到病毒與宿主的復雜相互作用[4-6]。

2 COVID-19患者不同器官/系統的臨床表現

COVID-19的主要傳播途徑是呼吸道飛沫和密切接觸傳播,接觸病毒污染的物品也可造成感染,傳染源主要是SARS-Co V-2感染的患者和無癥狀感染者[7]。越來越多證據顯示SARS-Co V-2并不局限于呼吸道,還能夠擴散到其它多種器官,這些器官組織中也存在ACE2受體不同程度的表達。因此,大多數COVID-19患者除了呼吸道癥狀,還存在神經系統、心血管、胃腸道、腎的功能失調。SARSCo V-2感染可能引起呼吸系統的癥狀包括發燒、干咳、喉嚨痛、多痰、身體不適、呼吸困難,嚴重的發展為呼吸衰竭[7-10]。病毒感染導致胃腸道可能出現厭食、腹瀉、惡心、嘔吐和腹痛等癥狀。常見的中樞神經系統癥狀是眩暈和頭痛,常見的周圍神經系統癥狀是味覺和嗅覺減退或喪失。隊列研究觀察到部分患者出現急性腎損傷、心肌受損和心臟衰竭,而部分患者出現丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)升高,表明病毒感染還可能殃及肝組織。同時,有報道顯示,近20%COVID-19患者出現皮膚異常,包括蕁麻疹、空泡、紫癜及丘疹樣鱗狀病變[7-10]。

3 SARS-CoV-2病毒成分在人體不同組織中的分布

為了探索SARS-Co V-2的傳染性和導致包括呼吸道在內的多器官衰竭機制的生物學基礎,利用尸檢組織觀察COVID-19相關的病理學和形態學變化、確認病毒成分在不同組織中出現,能夠獲得病毒感染引起組織、器官損傷的直接證據[4,11-15]。目前常用于證明人體組織存在病毒成分的方法包括病毒核酸檢測、電鏡、免疫組織化學。通過原位雜交或核酸擴增可以檢測病毒RNA在患者組織中的存在;透射電鏡技術由于能夠直觀觀察到病毒顆粒,適合調查COVID-19患者組織中病毒分布;利用針對病毒蛋白(S蛋白、N蛋白等)的特異性抗體進行免疫組織化學分析檢測患者組織中相應的病毒抗原,同樣能夠準確定位病毒成分在組織中的分布[4,12]。值得注意的是,直接通過透射電鏡觀察,僅僅根據形態學特征容易錯誤地將一些亞細胞結構判定為病毒顆粒。先前有文獻報道利用透射電鏡在各種尸檢樣品中觀察到SARS-Co V-2病毒顆粒,部分結果隨后卻受到質疑。因此,在透射電鏡的基礎上,需要結合其它技術如PCR、免疫組化、原位雜交、免疫電鏡技術等,才能確認透射電鏡觀察到的結果[12,15]。

Dorward等[13]對英國11例死亡患者尸檢,采集了37份不同解剖部位的樣品(來自上呼吸道、下呼吸道、心、胃腸道、腎、肌肉等器官),通過多重PCR、測序和原位免疫組化檢測病毒S蛋白的方式確定病毒在不同組織分布。所有器官和組織采樣點都檢測到SARS-Co V-2 RNA,呼吸道最常見,其它部位如胃腸道、心、肌肉也有檢出,從肝、腎及其它器官較少檢出,患者之間不同組織部位的病毒分布也存在差異。病毒S蛋白主要出現在呼吸道、胃腸道、肝、腎的上皮細胞,部分肺巨噬細胞(CD68＋細胞)、內皮細胞(CD105＋細胞)也檢測到S蛋白,與病毒進入細胞受體ACE2表達的分布一致,在PCR檢測SARS-Co V-2陰性組織中較少檢出,未感染SARSCo V-2的患者尸檢組織沒有檢出S蛋白。

Schurink等[14]對荷蘭一家醫院21名COVID-19死亡患者進行了前瞻性尸檢隊列研究,免疫組化發現多個器官存在SARS-Co V-2感染細胞。肺里病毒抗原最豐富,包括1型和2型肺泡細胞、內皮細胞、支氣管上皮、肺泡巨噬細胞等,其它器官包括上呼吸道、心、腎、胃腸道也檢測到病毒抗原。根據Trypsteen等對多項類似研究的總結,證明多種器官存在SARS-Co V-2病毒成分(病毒RNA、病毒蛋白),包括咽、氣管、肺、血液、心、血管、腸、腦、男性生殖器、腎,其中上呼吸道、肺、口腔、胃腸道和泌尿系統表達最高[4]。以上結果說明,SARS-Co V-2具有廣泛的組織嗜性,能夠在多種器官中檢出。

4 病毒在不同體液中分布及持續排放

既然多種宿主組織細胞存在受體ACE2表達,也在COVID-19患者不同組織器官中檢測到SARS-Co V-2病毒成分,完整的有感染性的病毒顆粒和成分也可以進入不同體液中,病毒還可能通過多種體液排出,并增加了病毒傳播給新宿主的機會,進而成為潛在的傳染源。因此,明確SARS-Co V-2在不同體液中病毒載量的動力學以及病毒排放持續時間,有助于全面認識病毒傳播和致病機制、妥善管理密切接觸者和患者、科學部署各種非藥物干預措施[16-22]。人體的體液包括血液、腦脊液、尿液、唾液、痰、眼淚、精液、乳汁、羊水和陰道分泌物等,病毒還可能通過糞便排放。COVID-19全球大流行疫情暴發以來,除了將常見的上呼吸道樣品(咽拭子、鼻拭子、喉拭子、鼻咽抽吸物等)和下呼吸道樣品(肺泡灌洗液、下呼吸道抽吸物等)作為病毒核酸檢測的主要樣品來源之外,國內外機構也嘗試過檢測不同體液樣品,探索病毒在不同體液的分布、病毒載量以及持續排放時間,采用的方法包括核酸檢測、病毒分離培養以及病毒抗原檢測[16-21]。核酸檢測陽性率最高的是肺泡灌洗液,其次為痰、鼻拭子、咽拭子、糞便、全血、尿[7]。

Wang等[18]在疫情早期就報道了我國205名患者1 070份樣品(咽拭子、鼻拭子、血液、痰、糞便、尿液等)的檢測,發現肺泡灌洗液陽性率最高,其次為痰、鼻拭子、纖維支氣管鏡活檢、咽拭子、糞便,血液樣品檢出率僅1%,72份尿液未檢測到病毒RNA。在各種樣品中,鼻拭子平均病毒載量較高(1.4×106copies/m L),其余樣品的平均病毒載量較低(＜2.6×104copies/m L)。同時報道從患者糞便樣品中分離到活病毒,表明病毒可能通過糞便途徑傳播,為疫情早期開展感染者篩查、患者管理提供了重要信息。

W?lfel等[19]對9例德國COVID-19患者不同樣品(口咽拭子、鼻咽拭子、痰、糞便、尿液、血液)進行了連續動態監測,發現咽部的病毒排放在出現癥狀第1周最高,第4 d口咽拭子病毒載量最高達到7.11×108copies/m L,隨后拭子樣品病毒載量下降迅速。出現癥狀后持續觀察到病毒排放,最長28 d仍然可能從拭子樣品檢測到病毒RNA。痰液的平均病毒載量為7.00×106copies/m L,下降速度稍慢。僅能從口咽或肺相關樣品中分離到有感染性病毒,糞便樣品盡管檢測到病毒RNA濃度較高,但未能分離到病毒。多數患者糞便中出現病毒RNA的持續時間與痰液一致,而27份尿液和31份血液均未檢測到病毒RNA。

Chen等[20]對深圳第三人民醫院145例COVID-19患者資料的分析顯示,入院時平均病毒載量為1.16×104copies/m L,其中,支氣管肺泡灌洗液最高,平均為5.7×104copies/m L,呼吸道樣品平均為4.9×103copies/m L,鼻咽拭子平均為1.32×104copies/m L,痰液樣品平均為2.9×102copies/m L,血液平均為4.2×103copies/m L。平均病毒排放時間為17.3 d,其中普通住院患者平均為12.1 d,進入危重病房的患者平均為24.4 d。核酸陽性、實時熒光PCR檢測Ct值較低的患者其病毒排放時間更長。以上結果,通過大量病例相關數據,總結了COVID-19患者病毒分布及變化規律。

Li等[21]采用數字PCR對37例患者185份樣品(鼻咽拭子、肛拭子、唾液、血液、尿液)進行檢測,樣品來自病程7～69 d。檢測陽性率分別為鼻咽拭子(54.05%)、肛拭子(24.32%)、唾液(16.22%)、血液(10.81%)、尿液(5.41%)。有的患者鼻咽拭子陰性,但其它樣品陽性。平均病毒載量(copies/test)分別為鼻咽拭子(16 224±67 507)、肛拭子(20±26)、唾液(5 677±13 647)、血液(16±9)、尿液(5.1±0),再次證明鼻咽拭子和唾液具有較高病毒載量,同時也準確地描述了不同體液中病毒載量。

根據Cevik等[22]對79項COVID-19研究的總結,SARS-Co V-2 RNA在上呼吸道平均排放時間為17.0 d,下呼吸道為14.6 d,糞便為17.2 d,血液16.6 d。報道的最長病毒排放時間為上呼吸道83 d,下呼吸道59 d,糞便126 d,血液60 d。另外,雖然偶爾有報道在個別案例中從腦脊液、乳汁、眼淚等樣品中檢出病毒RNA,這類體液樣品的總體檢出率極低[4]。

5 小結與展望

通過一年多來對COVID-19患者的持續觀察,已經證明SARS-Co V-2能夠感染人體多種器官,并且能夠從多種體液中檢測到病毒相關成分。雖然目前已經在病毒引起的呼吸系統病變取得一些共識,病毒在人體其它組織引起的病變及其機制尚未完全明確。因此,繼續監測分析病毒在不同組織的分布以及病毒從不同體液的排放時間,有利于全面認識病毒的致病機制,監測疾病變化和進程,研判疾病預后結果。隨著疫情形勢的發展,可以預見,在疫情完全終止之前的相當長一段時期內,對于病毒相關成分的監測仍然是必需的。在分析和利用這些檢測結果時,需要注意以下方面:1)謹慎解讀SARS-Co V-2病毒相關成分(病毒顆粒、病毒抗原、病毒RNA)在組織中檢出結果。一方面,透射電鏡觀察病毒顆粒一定要具備病理學、病毒學、形態學等多個學科的知識和經驗,并熟悉病毒形態、形態發生和正常亞細胞結構等領域,才能得出可靠的無爭議的結論;另一方面,在特定組織細胞中檢測到病毒抗原和病毒RNA不一定代表完整的有感染性的病毒,可能是過量表達的病毒抗原或病毒亞基因組,因此相關病理學改變不一定是病毒感染的直接病理損傷,出現陽性結果可能是因為這些病毒成分隨著體液循環被轉運到相應器官。2)提高檢測靈敏度,使檢測結論更加可靠。目前普遍采用實時熒光RT-PCR檢測病毒RNA,文獻中不同團隊報道的結果(如腦脊液、眼淚、乳汁等)存在沖突。主要原因在于一些實時熒光RT-PCR檢測體系敏感性不足,影響低病毒載量樣品的檢出率,這類樣品需要靈敏度更高的數字PCR平臺。因此急需在數字PCR平臺上,全面準確描述SARS-Co V-2在不同組織和體液中分布,深入認識致病機制,促進提高COVID-19診斷治療水平。3)合理選擇檢測樣品種類。如前所述,病毒在不同體液樣品中出現和持續排放的時間有差異,在臨床實踐過程中,應當根據已知的SARS-Co V-2在不同體液動態變化規律,調整檢測策略特別是樣品類型,在不同病程時間點采集合適的樣品進行分析,使臨床診斷更加精準,從而更加科學地開展感染者管理(出院、隔離和解除隔離)。4)正確認識病毒相關成分檢測結果與患者傳染性的關系。目前評判樣品是否具有傳染性的金標準是從患者樣品中分離培養得到完整的有感染性病毒顆粒。在感染部位、血液以及其它部位檢測到病毒RNA或蛋白,未來大規模人群的COVID-19疫苗接種還可能檢測到疫苗相關的病毒成分,所有通過核酸檢測到病毒RNA片段或免疫組化檢測到特定病毒抗原的結果,都不足以顯示樣品具有感染性。

綜上所述,在全球大流行COVID-19疫情背景下,繼續調查總結SARS-Co V-2在人體不同組織的分布和病毒在各種體液中持續排放時間,有利于深入理解SARS-Co V-2致病機制,選擇合理的臨床診斷檢材,評估各種醫療活動的感染風險,推動落實各種感染防控措施,促進感染者管理和治療以及科學防控COVID-19全球大流行疫情。

利益沖突:無

引用本文格式:張擁軍,凌華,陳愛平.SARSCo V-2的宿主組織分布和體液中排放研究進展[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1118-1122.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.153