黑木耳菌株農藝性狀評價與遺傳差異分析

宋吉玲，陸 娜，閆 靜，亢學平，黃小蘇，周小華

(1 杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024；2 延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 延吉 133001；3 桐廬縣農業技術推廣中心，浙江 桐廬 311500)

黑木耳隸屬木耳目木耳科木耳屬，俗稱云耳、細木耳[1]，其子實體富含蛋白質、粗纖維、碳水化合物及人體必需氨基酸，具有降血脂[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化和延緩衰老[6]等多種功效。

黑木耳作為我國三大食用菌栽培品種之一，其年產量僅次于平菇和香菇[7]。隨著“北耳南擴”[8]產業的發展，浙江、福建等南方地區袋栽黑木耳“全日光間歇噴霧栽培模式”得到了快速發展，形成了一定的產業規模[9]。而南方市場上的黑木耳菌株大多是從東北引進的，同名異物和同物異名的現象頻發，同時由于菌種擴繁的不規范，常常造成菌種質量、產量和抗性差的情況出現，嚴重制約了黑木耳產業的可持續發展。而且由于南北氣候條件差異較大，北方選育的黑木耳品種不一定適應南方高熱高濕的氣候條件，經常會出現耳片大、顏色偏黃、產量低的現象。因此為了更好地鑒別黑木耳種質資源之間的遺傳差異，并篩選出適合南方地區栽培的優質高產黑木耳菌株，從分子生物學和傳統農藝性狀方面對不同來源的黑木耳菌株進行評價分析就顯得尤為重要[10-13]。目前關于黑木耳品種篩選評價方面的研究報道較多，杜萍等[14]通過對16個黑木耳菌株的菌絲生長速度、長勢、栽培農藝性狀和產量進行測定，篩選出6個優質高產黑木耳菌株；郭曉帆等[15]通過比較5個黑木耳菌株在母種、原種和栽培種培養基上的菌絲生長情況、栽培及產量性狀等，篩選出朵型好、顏色黑，出耳快、齊，產量高的優質菌株Au29；鄭素月等[16]對北方地區19個黑木耳菌株的菌絲和出耳性狀進行比較分析，篩選出適宜河北地區栽培的4個優質高產黑木耳菌株(野森一代、黑丹一代、黑山和黑耳厚)。以上研究多注重從子實體商品性和產量方面對黑木耳菌株進行評價分析，而對菌絲生長情況、子實體農藝性狀與產量之間相關性的研究相對較少。為此，本研究通過ISSR技術對15個黑木耳菌株的親緣關系進行分析,同時結合菌絲生長速度、產量和子實體農藝性狀，篩選出適合南方地區栽培的優質高產黑木耳菌株，并對其農藝性狀與產量間的相關性進行分析，旨在為優質黑木耳種源選育和精準化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共15個，均為杭州市農業科學研究院選育、收集、保藏的菌株，詳細情況見表1。

表1 15個供試黑木耳菌株的信息

1.2 培養基及培養方法

母種培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

原種培養基：木屑83%，麩皮15%，石灰1%，石膏1%，含水量為55%～60%。

栽培種培養基：木屑88%，麩皮10%，石灰1%，石膏1%，含水量約為60%。

按栽培黑木耳的常規方法生產菌棒，使用15 cm×55 cm×0.05 mm的聚乙烯栽培袋裝袋，每個菌株接種150棒，設3個重復，菌棒接種后置于25 ℃條件下培養，待菌絲成熟后按常規方法進行出耳管理。

1.3 ISSR引物

從美國哥倫比亞大學(UBC)公布的100條ISSR通用引物中篩選出多態性高、擴增條帶清晰、重復性好的11條引物，委托杭州擎科生物公司合成。引物信息詳見有2。

1.4 黑木耳菌絲體的培養

從PDA平板上培養3 d的菌落邊緣取2 mm×2 mm的菌絲塊，接種于100 mL PDA液體培養基中，25 ℃淺層靜置培養10 d，收集菌絲，無菌水漂洗2次，無菌濾紙吸干水分，-80 ℃保存備用。

1.5 黑木耳遺傳差異分析

1.5.1 黑木耳基因組DNA的提取及檢測 供試15個黑木耳菌株基因組DNA參照新型快速植物基因組DNA提取試劑(BioTeke，北京)的說明提取，提取后測定DNA的濃度，并經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃保存備用[17]。

1.5.2 ISSR多態性分析 ISSR-PCR擴增反應在TC-XP型PCR儀(博日科技有限公司Bioer，杭州)上進行。ISSR-PCR擴增體系為：2×TSINGKE PCR Master(blue)預混體系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板(20 ng/μL)3 μL，用ddH2O補齊到20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，適當溫度退火(退火溫度視引物而定，具體見表2)30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 7 min，16 ℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳檢測，150 V電泳30 min。采用Chemi Doc XRS imaging system(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)對擴增圖譜進行拍照，有ISSR譜帶標記為1，無ISSR譜帶標記為0，構建初始數據矩陣。用NTSYSpc 2.1軟件計算遺傳相關系數，采用平均連鎖法(UPGMA)進行聚類分析，得到聚類圖譜。

表2 11條ISSR引物序列及退火溫度

1.6 黑木耳農藝性狀的觀測

記錄不同黑木耳菌株菌絲生長速度、菌絲長勢、現耳芽時間、出耳整齊度、耳片形狀、耳脈情況、耳片顏色等性狀，并測定耳片長度、寬度、厚度和產量等指標[18]。其中菌絲生長速度每隔5 d測量1次，記錄菌絲長勢，計算平均生長速度。菌絲平均生長速度(cm/d)=菌絲生長長度(cm)/菌絲生長天數(d)。耳片性狀選取第1潮30～50個鮮耳進行測定。耳片大小用游標卡尺“十”字形測量耳片直徑，子實體顏色深淺度為黑色、黃褐色、灰褐色。

1.7 數據處理

試驗數據以“平均值±標準差”表示。利用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析(ANOVA)和LSD檢驗。P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著。采用Pearson相關性分析法[19]分析菌絲生長情況、子實體農藝性狀與產量之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 15個黑木耳菌株的ISSR多態性分析

利用ISSR引物對供試的15個黑木耳菌株基因進行PCR擴增，ISSR-PCR擴增圖譜顯示，11條ISSR引物在15個黑木耳菌株間擴增出了71條清晰、穩定的多態性片段，片段長度為200～2 000 bp。引物UBC807的ISSR-PCR擴增結果如圖1所示，其他引物擴增圖略。

M.DNA Marker;A1～A15.黑木耳菌株編號，見表1

2.2 15個黑木耳菌株的聚類分析

從聚類結果(圖2)可以看出，A13與A14和A15之間的遺傳相似水平高于0.90，A14與A15相似系數達0.97，初步確認A14和A15為同一菌株，而A13與A14和A15菌株的親緣關系較近。在相似系數為0.50時可將15個黑木耳菌株分為2個類群。第一類群包括A1、A2、A3、A5、A6、A7、A10、A11、A12、A13、A14、A15共12個菌株；第二類群包括A4、A8和A9共3個菌株。15個黑木耳菌株的遺傳相似系數變異范圍為0.50～0.97，表明黑木耳遺傳差異較大，遺傳背景十分豐富。

圖2 15個黑木耳菌株的聚類分析結果

2.3 15個黑木耳菌株菌絲的生長情況

由表3可知，不同黑木耳菌株母種菌絲長勢差異不明顯，除A7菌株菌絲長勢稍弱外，其余菌株均長勢良好。其中A11、A12、A8和A9菌株菌絲生長較快，平均生長速度分別為0.258，0.247，0.247和0.243 cm/d；其次為A6、A14、A1、A15、A13、A10、A2、A4、A3和A7菌株；生長最慢的為A5菌株，平均生長速度為0.190 cm/d。15個黑木耳菌株整體抗雜性均表現較好，無污染現象發生。

由表3還可知，不同黑木耳菌株栽培種長勢差異不明顯，整體表現菌絲潔白、濃密、整齊。其中A4、A5、A3和A10菌株菌絲生長較快，平均生長速度分別為0.449，0.447，0.442和0.439 cm/d；其次為菌株A6、A7、A2、A14、A12、A1、A15、A11、A13和A9菌株；生長最慢的為A8菌株，平均生長速度僅為0.372 cm/d，與其他菌株存在顯著差異。

2.4 15個黑木耳菌株的產量

由表3可知，15個黑木耳菌株中，A6、A5、A3和A4的產量較高，分別為87.55，83.24，82.36和79.45 g/棒；其次為A8、A9、A15、A10、A13和A14；A11、A12、A1、A7和A2的產量較低，分別為59.36，58.18，57.53，53.26和49.30 g/棒。因此從產量性狀來看，可以淘汰產量較低的A11、A12、A1、A2和A7菌株。

表3 15個黑木耳菌株的菌絲生長及產量情況

2.5 15個黑木耳菌株的農藝性狀

由表4可知，各參試菌株打孔后現耳芽時間為20～36 d，其中A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11菌株現耳芽時間最短，為20～25 d；A12和A13菌株現耳芽時間較短，均為30 d；A1、A2、A14和A15菌株現耳芽時間較長，分別為36，35，31和32 d，菌棒易脫水，培養中后期菌棒變軟、長青苔、污染，因此應淘汰這4個菌株。

由表4還可知，在15個供試菌株中，耳片形狀多以單片為主，少量朵狀；6個菌株的耳片顏色為黑色，7個菌株為黃褐色，2個菌株為灰褐色；耳片長度為5.236～6.139 cm，寬度為4.068～4.608 cm，厚度為1.722～2.262 mm。在耳片厚度方面，A1和A6菌株耳片厚(厚度>2.0 mm)，A5、A9、A10、A14和A15菌株耳片薄(厚度<1.8 mm)；在耳片大小方面，A1、A3、A4、A6、A8和A9菌株耳片小(長×寬<5.40 cm×4.35 cm)，A5和A14菌株耳片大(長×寬>6.0 cm×4.5 cm)，其余菌株耳片大小比較適中。出耳整齊度也是影響黑木耳產量和質量的一個重要因素[20]，由表4可知，除A1、A13、A14和A15菌株出耳不整齊外，其余菌株表現良好。

表4 15個黑木耳菌株的農藝性狀分析

綜合分析菌株的農藝性狀可知，15個供試菌株中，A6菌株出耳快、齊，耳片顏色黑、小，產量高，適宜作為推廣品種使用；A13菌株出耳不整齊，A9和A10菌株耳片薄，A1、A2、A14和A15菌株現耳芽時間長、菌棒易污染，因此這些菌株應被淘汰；在產量性狀表現較好的A3、A4、A5和A8菌株中，A3、A5耳片為黃褐色、筋多，A4菌株耳片稍薄，A8耳片黃褐色、薄，因此這4個菌株不太適合栽培推廣，但可作為與抗性強、商品性優良的品種進行雜交育種的親本材料使用。

2.6 黑木耳產量與栽培及農藝性狀的相關性分析

通過Pearson相關性分析發現，黑木耳產量與耳片厚度、栽培種菌絲平均生長速度具有正相關性，相關系數分別為0.347和0.383；與現耳芽時間則表現出顯著負相關性，相關系數為―0.698；與耳片長度、耳片寬度和母種菌絲平均生長速度的相關性不大。

表5 黑木耳產量與栽培及農藝性狀的相關性

3 討 論

隨著分子生物學技術的快速發展，分子標記技術廣泛應用于作物遺傳多樣性研究中，而ISSR作為一種操作簡單、快捷、高效的檢測手段，常常用于食用菌遺傳多態性分析和種內菌株親緣關系的區分。任廣明等[21]運用ISSR分子標記技術對黑龍江伊春地區的23個黑木耳主栽品種進行遺傳差異分析，發現23個黑木耳菌株在相似系數為0.8時聚為3個類群，遺傳背景差異不大，親緣關系較近。而徐安然等[22]利用SSR標記對來源于全國不同地區的72份黑木耳栽培種和野生種菌株進行遺傳多樣性分析及分子身份證的構建，發現其遺傳差異比較大，同時也發現有同物異名的現象存在。李輝平等[23]應用ISSR技術對21個栽培黑木耳進行了遺傳多樣性研究，結果表明我國栽培黑木耳的遺傳背景十分豐富，遺傳多樣性很高。姚方杰等[24]基于毛木耳全基因組開發的SSR標記對27份毛木耳菌株的遺傳多樣性進行分析，結果表明供試菌株遺傳相似系數為0.618～0.971，說明毛木耳種質資源具有豐富的遺傳多樣性。本研究利用ISSR分子標記技術對15個黑木耳菌株基因組DNA擴增片段進行聚類分析，發現利用ISSR分子標記技術能夠將黑木耳菌株區分開來，并將15個菌株聚為2個類群，一類為來自浙江地區的菌株，另一類以東北地區菌株為主，但并未發現黑木耳菌株農藝性狀與地域分布之間存在相關性。這與李黎等[25]的研究結果不同，可能與目前我國各地相互引種、菌種來源不明確有關。

農藝性狀作為評價種質資源是否優良的一個重要指標，在栽培試驗過程中，研究者多是以子實體商品性和產量為主要評價內容。杜萍等[14]、郭曉帆等[15]及鄭素月等[16]從菌絲長勢、產量、子實體商品性等方面對黑木耳菌株進行農藝性狀的比較分析，篩選出適宜栽培的優良菌株。金鑫等[26]從菌絲長勢、子實體農藝性狀、多糖和麥角甾醇等方面篩選出適宜西南地區栽培的黑木耳品種。孫靖軒[27]通過對70個親本菌株的產量、熟性、朵型和鮮耳腹面顏色比較分析篩選出親緣關系較遠、性狀具有互補性的優良親本黑29和黑威9號。本研究通過對黑木耳菌株的菌絲生長、子實體農藝性狀和產量等指標進行綜合評價分析，篩選出適合南方地區栽培的優質高產A6(黑山)菌株和適宜作為育種材料使用的A3(916)、A4(Aa7)、A5(黑2)和A8(麗黑1號)菌株。同時，本試驗通過Pearson相關性分析發現，現耳芽時間與產量之間存在顯著負相關關系，即現耳芽時間越短產量越高；栽培種生長速度、耳片厚度與產量之間存在一定程度的正相關性，而母種菌絲生長速度與產量之間相關性不大，因此現耳芽時間和栽培種菌絲平均生長速度可以作為衡量菌株是否高產的評價指標。在研究過程中還發現，出耳整齊度與產量之間存在一定的相關性，但兩者之間具體有何種關系，還有待進一步研究。