中空纖維腫瘤模型研究進展

王雪婧,尹 玲,寇卜心,柴夢音,陳德喜,劉曉霓*,汪曉軍*

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院中西醫結合中心,北京 100069;2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院北京市肝病研究所,北京 100069)

抗腫瘤藥物的研發,從體外篩選到產品開發,需要經過體外藥物活性的篩選、體內動物異種移植實驗分析和人體臨床藥效研究三個方面,其中藥物體內療效的驗證更是研發過程的關鍵,需要在一種或多種腫瘤動物模型中展示,耗時長且耗材多。 因此選用一種簡單快速、準確可行的腫瘤模型進行初步體內療效的評估是非常必要的[1]。 中空纖維測定法是美國國家癌癥研究所(NCI)于1995 年建立的體內高通量篩選系統,已成為NCI 中常規的抗癌藥物篩選方法之一,使大規模篩選抗腫瘤藥物成為現實[2]。 近年來,隨著中空纖維測定法的廣泛應用,在最初基礎上有了新的應用進展,本文系統敘述了中空纖維測定法的優勢特點和最新應用進展。

1 中空纖維測定法概述

1.1 中空纖維測定法的簡介

中空纖維測定法是由Hollingshead 等[2]開發的一種藥物篩選方法,是Hollingshead 于1995 年在微囊法和中空纖維細胞培養系統的基礎上建立起來的體內高通量抗腫瘤藥物篩選模型[3-4]。 其操作方法是在聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維中裝入待測的腫瘤細胞,再根據實驗目的,將裝有不同種類腫瘤細胞的中空纖維管分別植入裸鼠皮下或腹腔,隔日給予受試藥物,實驗天數結束后取出中空纖維管,用MTT 比色法檢測腫瘤細胞的活性,從而得到藥物體內抗腫瘤活性的一種實驗方法。 如果與對照組相比,凈細胞生長減少50%或更多,則認為該藥物對特定纖維有影響[5-6]。

中空纖維測定法的關鍵在于中空纖維管的使用。 在實驗中所用的中空纖維管是由改良的聚偏氟乙烯(mPVDF)制作而成,其具有良好的生物相容性和穩定性,可以熱封和高溫蒸壓不會改變其孔徑大小,在控制細胞釋放、培養、封裝和移植研究方面都很理想,代表了分離技術的革命性進展。 其分子截留值(molecularweight cut off, MWCO)為 5.0×105,允許大分子和藥物自由通過,同時限制細胞通過。 另外獨特的著色特點便于不同細胞系的篩選[6-8]。

1.2 中空纖維測定法的優勢特點

數十年來的實驗研究表明,中空纖維測定法具有多方面優勢,如全真性,高通量性,效率性,節約性,普遍適用性等。 首先,中空纖維可以模擬全真的體內環境。 通過將中空纖維管中培養的腫瘤細胞植入動物體內,使得藥物有了體內的生理過程,藥物在體內經過轉運,并受到體內代謝的影響,是藥物體內藥效學篩選的一種合理性方法。 需要注意的是,異種移植實驗后血管的生成,新生血管對藥物傳送和敏感性的影響,HFA 并不能完全復制,因此可能存在假陰性結果。 其次,許多種不同的細胞系都適用于中空纖維分析,中空纖維測試法具有普遍適用性。 無論貼壁細胞系還是懸浮培養的細胞系都可以很好的生長,擴大了可篩選的腫瘤細胞系的種類,可以表現為體外細胞毒性實驗的體內轉移。 但是如果所用細胞系篩選藥物需要在傳統的異種移植試驗進行后續研究,則要求細胞系在免疫缺陷小鼠中是致瘤的。

其中高通量性是中空纖維測定法最突出的優勢。 相比較于異種移植的方法,中空纖維測試法可以高通量(一只小鼠多種細胞系)地進行化合物的初步篩選,大大提高了藥物體內測試的速度。 之前的研究表明,中空纖維試驗與異種移植試驗在藥物篩選方面具有良好的相關性,中空纖維可以用來克服異種移植的缺點。 移植到免疫缺陷小鼠體內的人類腫瘤在不需要免疫抑制劑的治療,并且與供者腫瘤細胞有著相似的組織學表現、核型和分子病理學[9-10],相似的治療敏感性以及相似的器官特異性轉移模式[11]。 另外,傳統的異種移植試驗在動物數量、試驗所需化合物、試驗完成時間和資金投入等方面的成本都很高,難以作為常規模型大規模開展,對于藥物研發期間大規模的體內藥效學篩選具有很大的限制性。 而HFA 僅需要少量的化合物,在最短的時間(少于兩周)內,花費最少的精力得到藥效的定量指標,在HFA 篩選中無活性的化合物免去了在異種移植實驗再次篩選的過程,加快了藥物研發進程。 此外,使用體內HFA 有助于減少實驗動物使用的數量,符合實驗動物替換、改善、優化(3R)的原則[12-14]。 綜上言之,中空纖維測定法的高通量性以及中空纖維試驗與異種移植實驗的高相關性,構建起了體外篩選和異種移植實驗之間的橋梁,使用體外篩選具有活性的化合物可以使用中空纖維試驗優先用于體內分析,是其應用價值的主要體現。

2 中空纖維測定法近十年的最新應用

腫瘤作為全球的一種常見疾病,其發病率和致死率高,抗腫瘤藥物的研發始終是各國具有挑戰性的難題。 過去大量的研究結果表明,HFA 是一種快速研究抗腫瘤藥物藥效學(例如,Pervilleines B and C[15], Paclitaxel and Pacliex[16], C1311 andSJG -13[13], ASI-145[17], YSL[18], TAS-102[19])和機制(例如,PCNA and Rb[20], p16[21], NF-κB[22])的有效方法。 在目前抗腫瘤藥物的研發過程中,HFA 已應用于抗腫瘤天然藥物的評價、抗腫瘤化合物藥效學評價以及基于基因組學、蛋白質組學的藥物分子機制研究等方面。 此外,利用HFA 進行新藥體內評估,并獲得體內藥效定量指標,有力推動了抗腫瘤新藥的研發進程。 以下總結了最近十年來中空纖維測定法在天然藥物及合成化合物中的藥效和機制評價應用。

2.1 中空纖維測定法在中藥等天然抗腫瘤藥物中的應用

近年來研究表明,利用HFA 可快速分析中藥有效提取物,由于天然藥物具有多靶點、多成分協同,代謝復雜等特點,因而需要在一個全真的體內環境展示體內藥效。 中空纖維模型的出現,將中藥提取物分析與體內藥效實驗有機結合起來[23-24],從中藥中發掘出最有效的抗腫瘤成分,同時可以針對機制做進一步的研究。

Adonis amurensis (AAM)是一種常見于東亞的植物,可以調節細胞生長和新生血管形成, Park等[25]利用 HFA 評價了 AAM 提取物對腫瘤細胞(SK-Hep1 和A549)生長的抑制作用,并探討其作用機制,結果顯示小鼠在25、50 和100 mg/kg AAM 的作用下,SK-HEP-1 細胞的活力分別顯著降低至65.9%、60.1 和59.2%,A549 細胞的活力顯著降低至81.8%、73.8%和71.7%,表明AAM 提取物具有較強的抗腫瘤活性。 另外研究AAM 激活自噬過程誘導腫瘤細胞死亡,用AAM 提取物治療癌細胞顯著增加了自噬體的形成,并參與了 AKT、ERK 和MAPK 等多種信號組分的激活。 此外,分離出一種活性成分,多苷。 提示中空纖維試驗對于中藥提取物的體內抗腫瘤活性檢測和后續機制的研究是有意義的。 瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L)是一種中藥, Liu 等[26]的研究結果表明其提取物(ESC,ESC-1 和ESC-2,后兩者均從ESC 中分離)對4 種不同腫瘤細胞(NCI-H157,NCI-H460,BEL-7402 和SKHEP-1)均具有體外細胞毒性和促凋亡作用,其中ESC-2 具有最強的抑制作用和最寬的敏感細胞譜。采用HFA 進一步觀察瑞香狼毒提取物在體內的抑制和促凋亡作用,結果與體外實驗結果一致,根據作用強度、劑量和抗腫瘤譜,ESCs 的抗腫瘤作用順序為:ESC-2＞ESC＞ESC-1,ESC、ESC-2 能顯著提高NCI-H460 細胞凋亡率和 caspase 3、8 酶活性。 ESC和 ESC-2 對 NCI-H460 細胞 Fas、Fas-L 蛋白表達無明顯影響,但TNF-α/TNF-R1 蛋白表達有明顯變化,結果表明ESC-2 具有與ESC 相似的體內抗腫瘤作用,進一步證實ESC-2 可能是ESC 的主要抗腫瘤活性部位,提示中空纖維試驗在天然抗腫瘤藥物有效提取物分析方面具有重要的應用價值。 此外,鄧晶晶等[27]應用中空纖維測定法評價了藤甲酰苷(gareinia glycosides, GG)對八種人癌細胞的體內抑制作用,結果與異位移植瘤實驗一致,張佳佳等[28]采用HFA 研究證實了細薄星芒海綿總萜烯(STS)對多種腫瘤細胞株的體內生長抑制作用,驗證了HFA 的可靠性。

2.2 中空纖維測定法在評價化合物體內抗腫瘤活性中的應用

近些年來,大量研究將HFA 應用于化合物體內抗癌活性驗證中,推動了具有抗癌活性新化合物的發現。 Frykn?s 等[29]鑒定了一種新的微管蛋白活性劑VLX40。 在小鼠皮下植入髓系U-937 細胞的中空纖維培養物中研究了VLX40 的體內活性,支持了體外研究成果,中空纖維是一種非常有抵抗力的體內腫瘤模型,需要藥物滲透到皮下植入的纖維中,因此與其他體內模型相比,體內腫瘤活動的假陽性率較低,有助于新藥的體內評估。 此外,Chen 等[30]研究評價了B-2(一種喹唑啉類藥物)對非小細胞肺癌(NSCLC)A549 細胞體外和體內存活和生長的選擇性作用。 中空纖維試驗顯示B-2 對A549 細胞的生長和存活有選擇性作用, 且呈劑量依賴性。Bachmann 等[31]使用HFA 研究描述了天然產物衍生的syrbactin 結構類似物TIR-199 以劑量依賴的方式抑制蛋白酶體,并誘導多發性骨髓瘤和神經母細胞瘤細胞以及NCI-60 細胞板中的其他癌癥類型的腫瘤細胞死亡。 提示采用中空纖維法可以獲得體內藥物療效的定量指標。 Behera 等[32]利用HFA 分析證實了Abrus precatorius 凝集素衍生肽10 kDA GP 對宮頸癌細胞(HeLa 細胞)的抗癌作用。 Lee等[33]通過中空纖維試驗作為半體內試驗,使用卵巢癌OVCAR5、結腸癌SW620、中樞神經系統U251 和黑色素瘤UACC62 四種不同的細胞系,分析了發現轉谷氨酰胺酶2(TGase 2)抑制劑GK13 可能對多種腫瘤細胞具有抗癌作用。 Nú?ez 等[34]利用中空纖維試驗驗證了新的米特拉霉素衍生物demycarosyl-3D-β-D-digitoxosylmithramycin SK 可能是一種有前途的抗腫瘤藥物。 Abonia 等[35]使用中空纖維試驗證實新型喹啉-2-酮查爾酮類化合物27 在50 株人腫瘤細胞株表現出最顯著的活性,提示化合物27 可作為開發新型抗癌藥物的先導化合物。 Jourdan等[36]利用NCI 中空纖維實驗討論了2-取代雌二醇-3,17-O,O-雙氨基磺酸酯(e2-雙氨基甲酸酯)類似物的合成及其抗增殖活性,顯示合成物49 和55 表現出顯著的抑制活性。 Eriksson 等[37]采用中空纖維小鼠實驗驗證了新的低分子量激酶抑制劑AKN-032 的體內活性,并表明該藥物具有良好的毒性。Pearce 等[38]利用中空纖維分析從真菌中發現新的抗癌藥物。 Gullbo 等[39]在HFA 中驗證了新化合物VLX50 可以顯著抑制卵巢PCPTC(原代培養的腫瘤細胞)的體內生長。 綜上,通過HFA 的廣泛應用可以看出,HFA 因其實用性、準確性已逐漸發展成為化合物體內抗腫瘤活性檢測中的關鍵步驟,在新藥研發中體現出了愈發重要的價值。

2.3 中空纖維測定法在抗腫瘤機制研究中的應用

Liu 等[40]觀察環孢素A(CsA)在體內外是否均能顯著增強環唑替尼對多個MET 擴增的NSCLC 細胞的抗腫瘤作用。 通過中空纖維試驗和異種移植實驗結果共同顯示環佐替尼可激活Ras 2(KSR2)信號的鈣調磷酸酶(CaN) 激酶抑制物,從而激活Erk1/2,提高癌細胞的存活率,CsA 能有效阻斷CaN-KSR2-Erk1/2 信號傳導,促進環唑替尼誘導的細胞凋亡和G2/M 期阻滯。 同樣,Erk1/2 的藥理學或遺傳抑制也增強了環唑替尼的體外生長抑制作用。 證實 CsA 或 Erk1/2 抑制劑 PD98059 通過抑制CaN-Erk1/2 軸增強了環唑替尼的抗癌活性。 Veiga等[41]通過體內/外 HFA 技術,在分子水平上監測DNA 插層劑和烷基化劑對DNA 雙鏈斷裂(dsb)誘導的影響,利用該方法評估DNA 插層劑和烷基化劑對人肺癌、結腸癌和乳腺癌細胞系的藥效學特性。使用標準藥物阿霉素,研究表明γ-H2A.X(dsb 檢測的可靠標志物)可以通過免疫印跡和流式細胞術可靠地檢測,證明HFA 可用于體內藥物/靶點作用機制的分析,同時從3Rs 的角度來看,對減少和改進動物的使用也有重大影響。 Oza 等[42]在特定的中空纖維藥代動力學模型中描述了一類Chk1(一種Ser/Thr 蛋白激酶)抑制劑,三唑喹啉酮/三唑酮(TZs)的合成和評價。 用拓撲替康(50 nm)處理中空纖維PD 模型中的HCT116 細胞,然后用TZ 類抑制劑16e處理,將HFA 應用于化合物結構-活性關系分析,該模型中TZs 與化療藥物和放療聯合應用的活性證實了該系列Chk1 抑制劑的有效性,另外結果顯示16e被證明以劑量依賴的方式消除拓撲替康誘導的細胞周期阻滯。 近年的這些研究顯示出了HFA 在機制研究上的可行性價值。

3 中空纖維測定法的改良優化

3.1 MiniPDX 模型

人源腫瘤異種移植模型(PDXs)是一種功能診斷的強大模型,對抗癌藥物反應具有高預測能力,但是受移植失敗、建立和擴展PDX 模型及隨后進行藥物療效測試耗時過長等因素的限制,阻礙了其在臨床上選擇正確、可行治療方案的快速決策,因此設計一種快速準確PDX 擴展模型是十分必要的。

在過去的研究中, 原代培養的腫瘤細胞(PCPTC)已經被證明可應用于預測診斷特異性活性和個體患者對抗癌藥物的反應。 Gullbo 等[39]首次將其應用于高通量篩選的新藥鑒定中,利用中空纖維模型證實了原代培養的人卵巢癌細胞在小鼠體內具有顯著活性,表明PCPTC 用于腫瘤藥物的高通量篩選是可行的。 目前,Zhang 等[43]對中空纖維腫瘤模型作出改良,將患者來源的腫瘤細胞注入中空纖維膠囊中,隨后對其細胞活性、形態和藥代動力學進行系統評價。 開發了一種先進的PDX 模型,命名為MiniPDX。 以PDX 模型為參考,實驗檢測了MiniPDX 的性能(敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值)。 結果顯示迷你PDX 膠囊中腫瘤細胞的形態和組織病理學特征與PDX 模型和原發腫瘤細胞一致,PDX 腫瘤移植物實驗的藥物反應與相應的MiniPDX 實驗的藥物反應有很好的相關性,其中MiniPDX 陽性預測值為92%,陰性預測值為81%,敏感性為80%,特異性為93%。 這些研究數據表明通過將MiniPDX 法應用于臨床腫瘤標本,顯示了其廣泛的臨床應用潛力。 在 Liu 等[40]的研究中,從MET 擴增肺癌患者中建立了3 株原代細胞株并將其注入纖維,在中空纖維模型中證實環孢素a(CsA)可促進環唑替尼(crizotinib)的抗腫瘤活性。 研究驗證了MiniPDX 試驗是一種先進的個性化癌癥治療工具,可用于快速檢測藥物療效,增強其在個性化癌癥治療中的價值。

3.2 胃癌細胞株和肝細胞肝癌細胞株的HFA優化

中空纖維試驗為體內抗癌藥物篩選提供了一種早期的方法,這些檢測方法已經針對肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌和腦癌進行了優化,但并非針對胃和肝的癌癥。 因此, Park 等[44]研究了優化人胃癌和肝癌細胞系的中空纖維檢測方法。 將中空纖維胃癌細胞株(SNU-16、SNU-484、SNU-668)和肝細胞癌細胞株(HepG2、SK-Hep-1、Hep3B)分別經皮下和腹腔移植到小鼠體內,然后用標準抗癌藥物紫杉醇治療。 比較不同細胞系紫杉醇中空纖維活性和異種移植活性。 在優化的條件下,在SNU-16 細胞中對新型化合物EW7197 和黃腐霉素進行檢測,發現中空纖維的活性與各化合物的異種移植物活性有很好的相關性[45]。

3.3 其他

體內臨床前分析需要篩選潛在的靶向腫瘤血管的藥物, Cooper 等[46]采用了中空纖維細胞分析技術,對NCI 試驗進行了修改,使其更適合于研究抗血管生成和其他血管靶向性策略,方法是僅皮下移植,并減少移植的纖維的大小和數量,以盡量減少纖維周圍因纖維封條損傷而產生的灌注周圍的組織。 并且將纖維周圍新生血管的免疫組化分析作為量化藥物效應的終點,描述了一種基于中空纖維的定量檢測腫瘤新生血管的方法。 戚欣等[47]比較了中空纖維測定法在免疫缺陷小鼠和免疫正常小鼠體內的應用,結果顯示KM 小鼠可以替代裸鼠用于中空纖維測定法對化合物的體內抗腫瘤活性進行初步篩選,昆明小鼠的使用可以降低實驗成本,進一步促進中空纖維法在我國的推廣應用。

4 小結與展望

抗腫瘤藥物的發現與篩選需要一種快速體內模型進行體內藥效學的評估,中空纖維測定法的出現,因其高通量性有力推動了抗腫瘤藥物的研發進程。 近些年來,大量研究將中空纖維測試法應用于新藥的體內評估上,推動了新化合物和天然抗腫瘤藥物等的研發。 此外,HFA 不僅應用于抗腫瘤藥物研究,更是一種特異的,高效的體內活性評估模型。在其他細胞的藥物活性研究[48]以及抗病原體(細菌、病毒等)藥物[49]的體內篩選方面也有著重要應用價值,還可以應用于血管生長分析。

然而在體內活性篩選方面,因其尚不能完全模擬腫瘤與宿主細胞之間復雜的反應,HFA 在目前無法完全取代傳統移植瘤模型。 在過去的研究中,采用中空纖維模型與異種移植腫瘤模型相結合,被證明是一種準確可行的藥效學評估方案。 HFA 的改良優化使其適用性更加廣泛,最新miniPDX 模型的出現推動了個體化腫瘤治療的研究進展。 利用患者來源的腫瘤細胞預測癌癥藥物對個體患者的臨床活性,miniPDX 模型在癌癥藥物臨床前開發以及個體化癌癥治療方面有著重要應用價值,在未來,可將miniPDX 模型用于藥物作用機制研究上。 綜上所述,中空纖維腫瘤模型因其簡便性、優越性、實用性在腫瘤藥物研發等方面展現出了重要的應用價值;更加值得注意的是,其在個體化治療上也顯示出了巨大的應用潛力。