新生兒壞死性小腸結腸炎發病機制的研究進展*

王 靜 綜述,米弘瑛 審校

(1.大理大學，云南大理671003；2.云南省第一人民醫院兒科，昆明 650032;3.昆明理工大學附屬醫學院，昆明 650032)

壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒期最常見且病死率較高的外科急危重癥，多發于早產兒，以嘔吐、腹脹、血便為典型的臨床表現。美國和加拿大的多中心新生兒網絡數據庫顯示，出生體重500～1 500 g的早產兒中，NEC的發生率為7%，病死率為20%～30%，近幾年無明顯改善[1-3]。有研究揭示NEC的發生與新生兒腸道動力和腸道黏膜屏障不成熟、免疫系統的易感性、腸道微生物不成熟與失衡、喂養不當等有關[4-8]，目前國內外研究尚未能闡明NEC的發病機制。

1 既往研究

新生兒NEC是由多種因素導致的腸道炎癥性疾病，發病機制復雜，常常與膿毒血癥、全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、循環衰竭等全身炎癥性疾病密切相關，其中早產和感染是其獨立相關的危險因素，尤其由革蘭陰性菌引起的膿毒癥伴發NEC時，病情較危重，腸穿孔發生率及病死率較高[9-11]。既往臨床研究顯示：NEC小鼠回腸組織Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)4及核因子-κB(NF-κB)表達升高,以及TLR9表達下降,提示TLR4介導的NF-κB信號活化是導致NEC發病的重要機制之一[12-13]。由腸細胞和巨噬細胞產生的炎性介質，尤其是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1、血小板活化因子和一氧化氮(NO)在NEC炎性反應中發揮重要的作用[14]。已證實血小板活化因子能夠誘導TLR4的表達和信號傳導，并募集大量炎性細胞及補體參與腸黏膜上皮的炎性級聯反應[15]。

腸道炎性反應常引起腸道黏膜上皮彌漫性水腫、缺血、壞死、脫落等病理改變，嚴重者導致腸穿孔，引起急性腹膜炎、彌散性血管內凝血、膿毒癥性休克、多器官功能障礙等并發癥。臨床上多以禁食、胃腸減壓、營養支持、抗感染、維持水電解質及酸堿平衡、糾正凝血功能障礙等治療為主[16]，對危重患兒采取外科手術治療[17-18]，目前尚無特異性治療方案。消皮素D(gasdermin D，GSDMD)的發現，無疑為探索新生兒NEC的發病機制及治療方法提供了新的研究方向。

2 研究新進展

2.1 由GSDMD介導的細胞焦亡可能參與NEC的炎癥機制

新生兒NEC是多種因素相互作用的結果，因其發病機制尚未完全清楚，目前臨床上尚無突破性的有效治療方案，導致其病死率較高、預后較差。隨著GSDMD家族的發現及研究的深入，GSDMD分子機制和在炎癥中的作用逐漸被廣泛認識。細胞焦亡是由GSDMD介導的一種特殊的程序性細胞死亡機制，無論在壞死機制上還是在細胞死亡形態上的分析，均與細胞凋亡和其他類型的細胞壞死不同。

近年來研究發現，GSDMD作為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1、caspase-4、caspase-5及caspase-11的下游分子，被切割成有活性的N-端結構域和無活性的C-端結構域，有活性的N-端結構與細胞膜上特定的磷脂分子如磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰絲氨酸和心磷脂等結合，介導非離子選擇性孔道的形成，耗散細胞內外的離子滲透梯度[19-22]；而被磷酸化激活的混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)同時與質膜結合形成可滲透的離子通道，二者共同發揮成孔作用改變細胞內外滲透壓的平衡[23]，導致細胞膨脹和崩解死亡,最后釋放出IL-1β等炎性介質發揮致炎作用[24]，同時將細胞內的微生物暴露出來，有利于機體對病原微生物的清除，在介導細胞裂解的過程中MLKL分子也發揮了重要作用。

在細胞焦亡的過程中，GSDMD是如何精確調控細胞死亡、如何參與NEC的發病及探索GSDMD特異性抑制分子是未來研究的重點方向。CHEN等[23]研究發現，GSDMD-N端存在α-螺旋結構，而MLKL中的N-末端也存在這種結構，這是MLKL齊聚和功能所必需的，因此，這種α結構可能是GSDMD-N端寡聚和細胞死亡所必需的，推測破壞這種結構就可能會抑制細胞焦亡的發生。相關研究顯示，caspase-1、IL-1β、IL-18、NLRP3等與細胞焦亡相關的分子在腸上皮及小鼠NEC模型中顯著高表達，從而提出細胞焦亡可能參與新生兒NEC的發病機制，且GSDMD基因有望成為治療NEC的靶基因位點[25]。

GSDMD不僅是介導細胞焦亡的關鍵分子，還參與中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)的發生。最新研究發現，這兩種細胞死亡方式均在NEC的腸黏膜上皮炎性反應中發揮不可或缺的作用。

2.2 NETs在NEC發生、發展中的作用

NETs是依賴于GSDMD形成的一種中性粒細胞死亡的特殊形式，它將細胞核DNA去致密化，隨后排出染色質，染色質被細胞毒性顆粒蛋白包裹，如髓過氧化物酶(MPO)、彈性蛋白酶和其他蛋白酶等，這些被特殊修飾的染色質和其他蛋白質結構被稱為NETs，這個過程也被稱作NETosis[26-27]。最新研究發現，GSDMD在NETs的形成中發揮重要作用，在中性粒細胞中，GSDMD被包括中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)在內的絲氨酸蛋白酶裂解，由被切割后的GSDMD-N端結構域的成孔作用導致細胞死亡[28]，在NETosis的過程中，GSDMD-N端結構域在細胞膜上形成孔以允許NETs的釋放[29-30]。除此之外，NETosis的發生與乙酸肉豆蔻酸佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)也密不可分[31]，PMA通過Nox依賴途徑誘導NETosis的發生，還能引起補體蛋白的最大釋放。無論是這種中性粒細胞的特殊死亡，還是大量炎性物質及補體成分的釋放，均可介導機體的炎癥級聯反應呈瀑布式的爆發。目前這種NETs的特殊死亡形式已經被證實參與了NEC的發病[30]，但其在NEC中具體的信號通路仍然不清楚，還有待進一步研究。

既往研究表明，中性粒細胞表面抗原CD64被證實對鑒別早發型和晚發型敗血癥及NEC具有良好的診斷價值[32]。通過比較CD64和C反應蛋白的診斷價值，發現CD64在LOS/NEC中是一個比C反應蛋白好得多的早期預警生物標記物[33-34]。總之，中性粒細胞CD64表達作為一種監測生物標記物，對識別極低出生體重兒LOS/NEC既靈敏(89%)又特異(98%)[35]。只是CD64在NEC診斷過程中具體的參考值范圍尚不清楚,其在NEC中的具體作用也未被完全詳細闡明。由此推測，在NEC的發病過程中，可能存在早期預警的生物標記物。

2.3 GSDMD介導細胞焦亡與NETSs的發生的機制

作為同時介導細胞焦亡及NETs這兩種程序性細胞死亡的關鍵分子，GSDMD是如何介導細胞焦亡與NETs的發生？這兩種機制是否只是在同一細胞死亡過程中的不同階段，即細胞膜完整性被GSDMD-N端結構的成孔作用破壞導致細胞焦亡，在細胞膜被破壞后釋放細胞內染色質及其他蛋白成分形成NETs，二者共同發揮作用；還是GSDMD通過不同的受體與配體結合作用于不同的細胞，獨立介導細胞焦亡和NETs的發生。有學者提出，在感染早期NETs的形成涉及中性粒細胞[36]，但中性粒細胞不發生溶解并保持多種任務能力，與上述設想有沖突，還有待于進一步深入研究。但針對GSDMD基因的特異性抑制因子阻止其表達可以阻斷細胞焦亡和NETs的發展過程是毫無疑問的。新生兒NEC的發病多伴隨著膿毒癥，感染、細胞焦亡、NETs等多種機制可能相互作用，形成惡性循環，而GSDMD是多種機制中的關鍵，阻斷其基因表達有可能打破這種惡性循環，為治療新生兒NEC提供新的理論依據。

3 展 望

由GSDMD介導的細胞焦亡和NETs在NEC發生、發展中的作用越來越受關注，近年來已有學者在研究能夠阻斷GSDMD基因表達的特異性抑制分子，并試圖闡述其信號分子通路，揭示其在NEC中的具體參與機制，但目前還無實質性的突破。雖然在研究過程中也發現了有早期監測意義的生物化學指標，但還需臨床上的進一步篩選。如能發現可以用來監測NEC的特異性生物化學指標，并且研究出GSDMD的有效特異性抑制分子，就可以做到早期診斷、早期治療，從而提高NEC的臨床治愈率并改善預后。