腎上腺素受體介導ROS產生的分子機制*

陳顯達， 張幼怡， 肖 晗

（北京大學第三醫院心內科、血管醫學研究所，國家衛生健康委心血管分子生物學與調節肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京100191）

交感腎上腺素系統過度激活是高血壓、冠心病、房顫和心衰等多種心血管疾病發生發展的重要病理因素。近年來，越來越多的研究發現，交感應激常導致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生增加。在生理情況下，ROS 在調節心臟發育、心肌細胞成熟、鈣離子流、興奮-收縮偶聯和血管張力方面發揮重要作用[1]。而在病理情況下，ROS 生成或代謝失控，引起ROS 水平升高，進而導致DNA、蛋白質和脂類發生氧化損傷，線粒體通透性轉換孔激活，線粒體功能障礙，乃至細胞死亡[2]。因此，過多ROS 的產生是心肌肥厚、心臟缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病等病理性心臟重構和心力衰竭進展的關鍵因素之一[3-6]。本綜述主要關注交感腎上腺素系統對心血管系統ROS 產生調控機制的研究進展，以期為心血管疾病的防治提供新思路。

1 ROS的產生

ROS包括超氧陰離子（·O2-）、羥自由基和過氧化氫（H2O2），是細胞呼吸和新陳代謝的副產物，或由專門參與氧化還原信號的酶產生。心血管系統ROS的來源主要包括線粒體電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）、線粒體和胞質中的某些代謝酶，如線粒體單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、環加氧酶（cyclooxygenase，COX）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）等，以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）。鑒于ROS 信號在心臟生理和疾病中的重要作用，ROS 信號必須受到嚴格的調控來維持細胞內氧化還原的穩態，以確保ROS信號發揮生理作用而不導致病理效應。細胞內ROS水平由一系列復雜的抗氧化物控制，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）/還原酶系統和過氧化物氧還蛋白（peroxiredoxin，Prx）/硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統，這些系統參與ROS 清除。當ROS 的產生量超過內源性清除能力時，就會導致細胞內ROS 蓄積。因此，與ROS產生過多類似，細胞清除ROS能力受損也會導致心臟功能障礙[7-10]。

2 腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）

有研究發現AR 可介導交感過度激活引起的細胞ROS 生成[11-14]。交感應激時，神經遞質兒茶酚胺通過與特定的腎上腺素受體結合來發揮作用。根據對激動劑及拮抗劑的親和力、所介導的信號通路和氨基酸序列的差異性，可將AR分為α1、α2和β三類。

α1-AR 激動時主要通過Gq/11蛋白激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），PLC 促進磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2）水解產生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）與二酰基甘油（diacylglycerol，DAG），DAG 繼而激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），調控鈣通道釋放鈣離子，介導平滑肌細胞收縮。α2-AR主要分布在血管的交感神經節后纖維的突觸前膜和后膜，通過與Gi蛋白偶聯使腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）活性降低，環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）生成減少，cAMP 依賴性蛋白激酶活性降低，引起平滑肌細胞的收縮。

β-AR 可以與Gs和Gi蛋白偶聯，此外也介導非G蛋白依賴的β-arrestin 信號通路。β1-AR 激動時主要通過偶聯Gs蛋白使AC 激活，cAMP 依賴性蛋白激酶激活，導致心肌細胞和血管平滑肌細胞L 型鈣通道的開放，鈣離子內流的增加，繼而引起心臟正性變力、正性變時作用和血管平滑肌舒張。

目前認為AR 激動能夠調控線粒體來源（包括線粒體呼吸鏈、線粒體融合分裂和線粒體MAO）及NOX 來源的ROS。另外，AR 還能通過抑制抗氧化系統下調ROS 的清除能力，導致ROS 蓄積。下面我們將從上述3 個方面對AR 調控心血管系統ROS 產生的機制進行綜述（圖1）。

3 AR介導線粒體來源的ROS

3.1 線粒體ETC 在機體內，線粒體呼吸鏈是能量生產的中心。它具有偶聯呼吸鏈復合物之間電子轉移和線粒體內膜上質子運輸的功能，以產生合成ATP 所必需的電化學梯度。在氧消耗和ATP 產生之間，電子向下傳遞通常不是完全偶聯的。因此，一小部分（＜0.1%）電子可以從ETC 中泄漏，有一部分O2被還原，形成或H2O2。其中，最為重要的是它是大部分ROS 的前體，主要由線粒體內膜呼吸鏈中的酶復合體I、III產生。

生理狀態下，β-AR 激動通過經典的Gs/AC/cAMP/PKA通路發揮正性肌力作用，促進線粒體三羧酸循環、氧化呼吸增強和耗氧增多，導致更多的電子通過ETC 泄漏到線粒體內外膜間隙，故線粒體ROS產生增多。蓄積的ROS 最終擴散到胞質中，作為信號分子發揮氧化作用[15]。病理情況下，持續激活的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）能使多種參與胞內鈣離子調控的關鍵分子發生磷酸化，包括L 型鈣通道（L-type calcium channel，LTCC）、雷諾丁受體（ryanodine receptor，RyR）、受磷蛋白（phospholamban，PLN）和肌漿/內質網Ca2+-ATP 酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）[15-20]，進而導致胞內鈣超載，線粒體膜上鈣離子單向轉運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）攝取的鈣離子增多而使線粒體內鈣離子濃度異常升高，線粒體內膜兩側電勢差（mitochondrial membrane potential，MMP）升高，線粒體功能異常，產生的ROS 增多[21-23]。Theccanat 等[24]的研究發現，β-AR 激動所引起的ROS 產生增多并不完全依賴于PKA通路，可見β-AR激動導致ROS產生增多還存在別的機制。本課題組前期研究發現，急性β-AR 激動導致ROS 的產生分2 個階段，分別是早期階段（10～15 min）和延遲階段（90～120 min）。在新生小鼠原代心肌細胞中，β-AR 激動的早期（15 min），線粒體ROS 的產生依賴于cAMP/PKA 通路；而延遲期（2 h）則由非經典的G 蛋白偶聯受 體 激 酶2（G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2）/β-arrestin-1/NOX4 通路介導，且早期ROS 的產生以線粒體為主而不是胞漿NOX來源[25-26]。

3.2 線粒體分裂 線粒體在哺乳動物細胞中是一種動態變化的細胞器。隨著各種刺激和代謝的需要，線粒體的形狀、大小、數量和位置不斷變化。線粒體分裂和融合的平衡決定了線粒體的形狀，這也是維持線粒體和細胞功能的關鍵。線粒體通過不斷的分裂融合過程維持自身穩定，分裂會使線粒體碎片化，而融合則促進線粒體形成管網狀結構。在病理和不利因素作用下，線粒體過度分裂，發生碎片化，ETC 遭到破壞，導致大量電子漏出和ROS 產生。而線粒體融合增強可提高呼吸鏈相關蛋白活性，修復損傷線粒體，降低氧化應激水平[13]。有研究發現，AR 可以通過影響線粒體分裂和融合蛋白的活動進而調節線粒體ROS 的生成[27]。苯腎上腺素（phenylephrine，PE）特異性激動大鼠原代心肌細胞的α1-AR后，Gq/蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）通路激活，PKD 由胞質轉移到線粒體外膜上，使線粒體發動蛋白樣蛋白1（dynamin-like protein 1，DLP1）第616 位和第637 位絲氨酸發生磷酸化，隨后磷酸化的DLP1 轉移至線粒體內，線粒體分裂，引起線粒體膜孔開放增多、產生的ROS增多和呼吸增強，并激活凋亡[13]。此外，這2 個位點同時也受β-AR 調控。β1-AR 可分別通過鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）和PKA通路使得DLP1第616位和第637位絲氨酸磷酸化；β2-AR 可通過蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）和PKA/鈣 調 磷 酸酶（calcineurin，CaN）分別使DLP1 第616 位和第637 位絲氨酸磷酸化，隨后轉移到線粒體外膜，進而線粒體發生分裂，產能增多的同時ROS 產生也增多[27-28]。由此可見，DLP1 的這2 個絲氨酸位點與線粒體分裂密切相關，且其磷酸化受AR的調控。

3.3 MAO MAO 存在于線粒體外膜，負責兒茶酚胺（如腎上腺素、多巴胺和血清素）氧化脫氨的同時，還能產生H2O2、NH4+和活性醛。MAO 有A 亞型和B亞型（MAO-A 和MAO-B）之分，是線粒體H2O2的重要來源之一。Kaludercic 等[29]的研究證實，用去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）刺激分離培養的新生和成年小鼠心肌細胞時，MAO-A 被激活，隨后心肌細胞體積變大，ROS 產生增多，并表現為心肌細胞肥大。所有這些離體細胞的表型不完全依賴于α-AR 和β-AR 信號通路，并且可被MAO-A 的抑制劑氯己定（clorgyline）抑制。在壓力超負荷導致左室擴張和心力衰竭的小鼠模型中，MAO-A 對NE 的分解代謝增強并伴有氧化應激加重。提示AR 可能通過激活線粒體外膜上的MAO-A 促進ROS 生成，但是具體分子機制仍有待研究。MAO-B 的作用與MAO-A 相似，在人和小鼠的心臟中均有表達。有研究稱MAO-B 敲除可以改善由壓力負荷誘導的心衰[30]，但是關于腎上腺素受體激動與MAO-B的關系尚未見報道。

4 AR調控NOX來源的ROS

除了線粒體，ROS 的另一個重要來源是分布于質膜和多種細胞器膜上的NOX。NOX 家族共有7 個成員，即NOX1～5 型及Duox1 和2 型，是一類參與細胞內ROS生成的酶，能催化NADPH 的電子向分子氧轉移，生成超氧化物和過氧化氫[31]。NOX 由2 個與膜相關的催化亞基（NOX 和p22phox）和3 個細胞質調節亞基p47phox、p67phox和p40phox組成。鑒于NOX2 是第一個被發現的NOX 亞型，并且對其激活機制的研究比較豐富，以下我們就以NOX2 亞型為例對NOX 的激活過程進行闡述。靜息狀態下，NOX2和p22phox（也被稱為細胞色素b-245輕鏈）共同構成未激活復合物定位于細胞膜上，而p40phox（也被稱為中性粒細胞胞質因子4）、p67phox（也被稱為中性粒細胞胞質因子2）和p47phox（也被稱為中性粒細胞胞質因子1）則位于細胞質內。此外，NOX2 完全激活還需要與小GTPase p21-RAC1（也被稱為Ras 相關的C3 肉毒毒素底物1）在膜上進行組裝。當NOX2激活時，RAC1被募集到胞膜上，p47phox被PKC 磷酸化并與p67phox和p40phox一起轉運到膜上。由于p47phox發生磷酸化改變了其構象，使得p47phox的Src 同源結構域SH3 可以結合到p22phox胞質側碳端富含脯氨酸的區域上，實現了NOX2的激活[31]。

心肌細胞和血管內皮細胞表達NOX1、NOX2、NOX4 和NOX5 這4 種亞型，血管平滑肌細胞表達NOX1、NOX4和NOX5這3種亞型[31]。目前已知的受AR 調控的亞型主要是NOX2 和NOX4。盡管它們的結構相似，但二者存在明顯的差異。例如，NOX2 需要胞質中的一些調節亞基才能激活，而NOX4 則不需要。NOX2 和NOX4 在不同的細胞類型中有不同的亞細胞定位。一般來說，NOX2 主要定位于質膜，而NOX4 則主要定位于細胞內膜，包括線粒體、內質網和細胞核膜。多種細胞外刺激通過細胞內第二信使使NOX2 快速激活。而NOX4 是持續性激活的，其活性主要與表達量相關，受其表達水平的調控[32]。但是，也有研究發現，在血管平滑肌中，NOX4/p22phox復合體活性受聚合酶δ 相互作用蛋白2（polymerase δ-interacting protein 2，POLDIP2）的調控，后者能與NOX4/p22phox相互作用并提高NOX4 的活性，從而介導ROS 的產生和Rho 依賴的細胞骨架重塑及細胞遷移[33]。

在成年大鼠心肌細胞中，特異性激動α1-AR 后，產生的ROS明顯增多，并激活了下游的Ras-MEK1/2-ERK1/2 通路，導致心肌肥大。增多的ROS 只能被NOX 的抑制劑[二苯多銨、氧化苯胂、4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟和鎘]抑制，而不受線粒體ETC、NOS、XO 和COX 的抑制劑的影響[34]。這提示心肌細胞α1-AR 激動引起的ROS 產生主要來自NOX。Matsushima 等[35]用PE 特異性激動小鼠心肌細胞的α1-AR，發現NOX4 的表達水平呈劑量依賴性上調。進一步研究發現，α1-AR激動會通過核膜上的NOX4引起核內ROS 產生增多，最終導致心肌肥厚。而在主動脈血管平滑肌細胞中，α1-AR 長時間（大于4 h）激動會通過NOX 引起ROS 產生過多并導致細胞凋亡[36]。Tsai等[37]用NE 處理內皮剝脫的大鼠尾動脈，發現NE 激動α1-AR后能激活NOX產生大量ROS，并通過RhoA/Rho 激酶依賴途徑改變肌球蛋白磷酸酶介導的肌球蛋白輕鏈20 磷酸化，進而促進血管平滑肌收縮。NOX2 被激活后，產生的ROS（尤其是H2O2）會激活原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，導致表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）轉激活和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）依賴的RAC1 活化；RAC1 作為NOX2 的亞基之一，它的活化能增強NOX2 的活性，進一步放大NOX2的激活[31]。

β-AR 激動除了通過上述經典的cAMP/PKA 通路引起線粒體ROS產生增多外，還能通過上調NOX4的表達來促進ROS產生[24，38]。Theccanat等[24]的研究發現，用異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）刺激H9c2心肌細胞會引起NOX4 表達升高（NOX2 表達水平無明顯變化），提示NOX4 是β-AR 激動后線粒體產生ROS 的主要來源之一。進一步研究發現，ISO 引起的NOX4 表達水平升高不通過經典β1-AR/cAMP/PKA 通路，而是由β1-AR/GRK2/β-arrestin 通路介導。如果敲減GRK2的表達，或是使用了NOX4的干擾RNA 后，β-AR 激動所引起的ROS 增多受到抑制；而使用β-arrestin 過表達腺病毒則促進ISO 引起的ROS產生增多。Saleem 等[12]的研究發現，用AR 激動劑NE（能同時激動α-和β-AR）處理大鼠心肌細胞系H9c2，短時間（10 min）內產生的ROS 主要來自被激活的NOX2，且ROS 定位于胞漿和內質網，而不是線粒體。

上述研究提示，α1-AR 激動可以通過激活質膜上的NOX2促進胞質ROS的生成。此外，α1-AR激動還可引起核膜NOX4 表達水平升高促進細胞核內ROS產生增多，誘導心肌細胞肥大。而β1-AR激動則導致線粒體內膜上的NOX4 表達水平升高進而促進線粒體ROS的生成增多。目前尚未發現直接證據證明β1-AR激動能夠增強NOX2活性來促進ROS產生。

5 AR調控抗氧化系統

為了防止ROS 的積累，心肌細胞具有小到ROS清除劑，大到結構復雜的抗氧化酶共同組成的抗氧化系統[39]，包括SOD、CAT、GPx 和Prx/Trx 系統等。NADH 是在三羧酸循環過程中產生的一類重要的抗氧化分子。在生理條件下，線粒體煙酰胺核苷酸轉氫酶（nicotinamide nucleotide transhydrogenase，NNT）催化NADH+NADP+→NADPH+NAD+的反應，增強NADPH 依賴性的抗氧化能力，以清除氧化磷酸化過程中產生的ROS。而在心臟病理性超負荷期間，該反應發生逆轉（NADPH+NAD+→NADH+NADP+），以犧牲NADPH 依賴的抗氧化能力為代價，再生NADH來維持ATP的供應。

當β-AR 激動發揮正性肌力作用時，高負荷工作的心肌依賴線粒體呼吸來維持足夠的能量供應。隨著工作負荷的增加，ATP 水解速率的提高會刺激氧化磷酸化，從而通過ETC 加速線粒體NADH 氧化和電子傳遞。因此，從ETC 中漏出的單電子率更高，產生的ROS 增多。與此同時，為了產生更多的ATP 而大量消耗NADH 和NADPH，從而線粒體的抗氧化防御系統被削弱。Srivastava 等[40]的研究發現，ISO 能通過β1-AR 使心肌細胞抗氧化能力明顯減弱，包括使SOD1（即copper/zinc SOD，Cu/Zn-SOD）活性及其mRNA 和蛋白水平下降，使正性調控SOD 表達的轉錄因子Elk-1 減少，負性調控因子YY-1 增多，但是對于SOD2（即manganese SOD，Mn-SOD）、CAT 和GPx無明顯影響。

6 小結

大量研究表明，AR 激動引起的ROS 產生過多是心血管疾病病理生理過程中的重要環節。在心血管疾病的發病過程中，ROS由多種來源產生，主要是線粒體氧化呼吸鏈和NOX。但是，AR 對不同ROS產生系統的調控機制尚不十分明確。因此，對AR 調控ROS產生機制的進一步探究將為心血管疾病的發生發展提供新的見解，如AR 激活調控線粒體MAO和NOX 的分子機制。選擇性靶向特定的關鍵分子，如不同亞型的NOX 或MAO-A 以糾正線粒體功能障礙，從而抑制ROS產生，可能是一種用于治療各種心血管疾病的非常有益的新策略。