生物制品中內(nèi)毒素的危害及其去除方法的研究進展

李生軍， 張海霞， 馮若飛*

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

在生物制劑生產(chǎn)過程中由于不可避免的細菌污染，導(dǎo)致革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分殘留于生物制劑中，這種脂多糖是由革蘭氏陰性菌死亡或分解后釋放的，又稱內(nèi)毒素[1]。革蘭氏陰性菌中最具代表的大腸桿菌由于其具有轉(zhuǎn)化效率高、重組蛋白產(chǎn)率高、易于控制和易于放大等優(yōu)點，因此，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達[2]。然而，大腸桿菌表達的重組蛋白在純化過程中同時伴隨著內(nèi)毒素的殘留，由于機體對殘留的LPS有免疫識別作用，在機體內(nèi)作用于單核巨噬細胞并產(chǎn)生多種細胞因子，適量的細胞因子可激活免疫系統(tǒng)，對機體有益，而過量則可引起機體嚴重的病理反應(yīng)，輕微時表現(xiàn)為發(fā)熱、休克、心率過快，嚴重時生物制劑中殘存的LPS經(jīng)血液引起致命性敗血癥，并伴有多器官功能衰竭甚至死亡[3-4]；每年全世界有超過500萬人死于敗血癥，敗血癥的治療已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個嚴峻挑戰(zhàn)，細菌來源的生物制劑從本質(zhì)上限制了其在人類和其他哺乳動物中的使用[5]。因此，必須對生物制品中的內(nèi)毒素進行去除或使其達到藥品規(guī)定的內(nèi)毒素含量標準后方可使用[5]。目前報道去除內(nèi)毒素方法根據(jù)作用方式主要有超濾法、活性炭吸附法、親和吸附法、離子交換層析等。

1 內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特征

LPS是革蘭氏陰性菌細胞膜上的主要結(jié)構(gòu)成分，包被約四分之三的外膜，LPS由多糖O抗原(O-PS)、核心多糖(C-OS)和類脂A(Lipid A)構(gòu)成[6]。O-PS由2～6個寡聚糖組成，是LPS中最容易發(fā)生變異的部分，由于細菌種類不同所以多糖O-PS組成亦不同；C-OS主要的作用是連接類脂A和O-PS，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脫氧辛酸等組成[7]。類脂A是LPS中最小的結(jié)構(gòu)單位，也是最為保守的部分，同時也是LPS的活性中心，決定著細菌的致病性，其成分是由氨基葡萄糖雙糖構(gòu)成的親水性骨架和疏水性脂肪酸鏈組成的磷脂[6]。迄今為止，多種細菌類脂A的化學(xué)結(jié)構(gòu)已被測定，主要不同之處在于脂肪酸和磷酸基團的差異[8]。

脂類A作為LPS生物活性的主要集中部分，通過與靶細胞的受體蛋白分子相互作用，激活復(fù)雜的信號通路，最終導(dǎo)致機體發(fā)生一系列病理反應(yīng)，類脂A過度刺激天然免疫會導(dǎo)致器官損傷，嚴重休克，甚至可能會導(dǎo)致哺乳動物和人類死亡[9]。

2 內(nèi)毒素與外毒素的區(qū)別

內(nèi)毒素由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，其主要成分是脂多糖，具有很強的耐高溫屬性，250 ℃高干熱滅菌才能破壞其生物活性，故難以徹底清除[10]。在細菌入侵機體時沒有組織器官的選擇性，內(nèi)毒素會因細菌種類的不同存在或多或少的差異，但是致病后的臨床癥狀卻大同小異，主要表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、敗血癥等[11]。外毒素主要是由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，例如破傷風(fēng)梭菌、白喉棒狀桿菌、肉毒梭菌，部分革蘭氏陰性菌也可產(chǎn)生，如產(chǎn)毒性大腸桿菌，以及霍亂弧菌等[12]。其主要成分是蛋白質(zhì)，因此，對化學(xué)物質(zhì)和熱原很敏感，極易喪失生物活性，用3%～4%的甲醛溶液處理其毒性可完全消失，但是其抗原性較強，可誘使機體產(chǎn)生抗毒素[13]。

3 內(nèi)毒素的致病性

3.1 發(fā)熱反應(yīng)

人體對LPS極為敏感，極微量內(nèi)毒素就能引起體溫上升，這主要與脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、白細胞分化抗原(CD14)所介導(dǎo)的反應(yīng)有著密切的關(guān)聯(lián)。當機體受到細菌感染后，LPS與LBP結(jié)合，并與LPS的受體CD14形成LBP-LPS-CD14復(fù)合體，由于CD14沒有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，同時也沒有蛋白酶水解活性，導(dǎo)致CD14無法單獨將胞外信號傳遞至胞內(nèi)，此時Toll樣受體4就承擔起跨膜信號傳導(dǎo)的重任[14-15]。LBP-LPS-CD14復(fù)合體激活TRL14，TRL14與Toll/interleukin-1 receptor(TIR)區(qū)域相互作用，激活髓性分化因子88(MyD88)、IL-1R相關(guān)的激酶(IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，這些相關(guān)因子分別被磷酸化后向細胞核內(nèi)移位并作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動核內(nèi)基因表達，激發(fā)LPS刺激所介導(dǎo)的細胞反應(yīng)，致使細胞分泌大量的TNF-α、IL-6以及IL-1，最終刺激免疫系統(tǒng)抵抗入侵的細菌和引發(fā)炎癥反應(yīng)，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱[16-19]。

3.2 內(nèi)毒素休克

當機體中侵入大量革蘭陰性病原菌并死亡時，會在機體中釋放大量LPS進入血液，使機體發(fā)生內(nèi)毒素血癥。而這些機體中的內(nèi)毒素作用于巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、血小板以及補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等，并產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α、組胺、前列腺素、激肽等生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)作用于小血管臨床表現(xiàn)為微循環(huán)衰竭、低血壓、缺氧、酸中毒等功能紊亂而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，這種病理反應(yīng)叫做內(nèi)毒素休克[20]。當機體接受有效的治療后，會導(dǎo)致細菌大量死亡崩解，進一步導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素升高，并加重內(nèi)毒素血癥。大量的動物實驗及臨床實踐表明，內(nèi)毒素可造成人及動物多系統(tǒng)的多種疾病，其中包括肺損傷、肝損傷、腸損傷、腎損傷及彌漫性血管內(nèi)凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能臟器衰竭[21]。

4 內(nèi)毒素的去除方法

4.1 超濾法

隨著膜分離技術(shù)的迅猛發(fā)展，在生物制藥中利用物質(zhì)分子大小去除內(nèi)毒素的超濾法越來越受研究者的青睞。羅濛[22]利用截留相對分子質(zhì)量為30萬的超濾膜對狂犬病疫苗進行濃縮超濾，內(nèi)毒素檢測結(jié)果顯示，去除效率可達87.5%～98.7%。李村玉等[23]采用截留相對分子質(zhì)量10×103的超濾膜對甘草酸中的內(nèi)毒素進行超濾，并以超聲進行輔助，實驗結(jié)果顯示，內(nèi)毒素去除率可達93.7%，超聲后的甘草酸的透過率可達92.3%，有效的提高了制劑的安全性。超濾法是基于分子量的大小去除內(nèi)毒素，適用于水溶液和小分子溶液去除內(nèi)毒素，在蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)使用超濾法會導(dǎo)致有效分子大量流失。

4.2 吸附法

4.2.1 活性炭吸附法

活性炭由于其表面積大、吸附能力強、價格低廉、操作簡易等優(yōu)點，被廣泛的用于內(nèi)毒素去除，最適用于去除低分子量疏水性內(nèi)毒素，在微酸性條件下去除效果最佳。李淼等[24]采用活性炭吸附研究熱毒寧注射液中細菌內(nèi)毒素去除效果，實驗結(jié)果表明，活性炭對內(nèi)毒素吸附率為78.7%，能夠有效的截留細菌內(nèi)毒素，提高了熱毒寧注射液的安全性。孔祥文等[25]以活性炭為吸附劑，以牛血清白蛋白、牛血清紅蛋白、溶菌酶溶液為原材料，活性炭的吸附效率分別為33.1、51.1和216.5倍。但是由于活性炭的非選擇性，所以目的蛋白過多損失，且樣品處理后的活性炭不易除去，影響產(chǎn)品的后續(xù)使用。

4.2.2 親和吸附法

親和吸附法采用種類繁多的吸附劑，是以瓊脂糖等為基質(zhì)，通過與內(nèi)毒素有特異性相互作用的配基偶聯(lián)。吸附劑配基帶的正電荷與內(nèi)毒素磷酸基團之間的離子作用，使得吸附劑對制劑中的內(nèi)毒素有高度的特異性與選擇性；比較其他方法，在目標蛋白損失最小的情況下，能更有效地去除制劑中的內(nèi)毒素[5]。Petsch等[26]以聚賴氨酸、多黏菌素和組氨酸為配基的親和膜為材料，研究親和膜對內(nèi)毒素的吸附去除效果，實驗結(jié)果表明，以上配基均有很好的去內(nèi)毒素效果。Wei等[27-28]研究以脫氧膽酸、聚賴氨酸、聚二甲亞胺以及各種氨基酸為配基的親和吸附劑去除內(nèi)毒素，實驗表明以上配基所帶的電荷以及配基的極性對吸附內(nèi)毒素的效果有很大的影響；此外，脫氧膽酸、聚賴氨酸、聚二甲亞胺等聚陽離子配基對去除帶正電荷的內(nèi)毒素均很有效。

4.3 離子交換層析

根據(jù)樣品和內(nèi)毒素等電點的不同，可以選用不同的陰離子和陽離子交換介質(zhì)，使內(nèi)毒素分離的同時達到蛋白純化的目的。姬秋彥等[29]用陰離子交換層析柱Capto Q和Capto adhere去除百日咳和絲狀血凝素中的內(nèi)毒素，可以達到現(xiàn)行國外聯(lián)合疫苗實施的標準，并且純化后的樣品保持較好的活性。肖蘭艷等[30]采用離子交換法去除重組巴西堅果過敏原蛋白Ber e1溶液中的內(nèi)毒素，去除率為99.99%，內(nèi)毒素濃度為6.25 EU·mL-1，蛋白回收率為42.8%。徐向榮[31]通過Q Sepharose層析法去除內(nèi)毒素，重組人血清白蛋白干擾素中的內(nèi)毒素在介質(zhì)上的結(jié)合力比蛋白質(zhì)強，所以很難洗脫，用高鹽緩沖液才能洗脫內(nèi)毒素，最終溶液中內(nèi)毒素含量降低，同時純度也有所提高。

5 問題與展望

超濾法和活性炭吸附法由于對目標分子是非特異性選擇，所以會導(dǎo)致有效分子流失[32]；活性炭吸附法在樣品處理后活性炭不易除去，影響產(chǎn)品的后續(xù)使用；而親和吸附法和離子交換層析對制劑中的內(nèi)毒素有高度的特異性與選擇性，相比較而言，在目標蛋白損失最小的情況下，能更有效地去除制劑中的內(nèi)毒素[33]。

內(nèi)毒素普遍存在于生活中，適量的內(nèi)毒素可促進細胞因子激活免疫系統(tǒng)，對機體有益，而過量則可引起機體嚴重的病理反應(yīng)，所以注射制劑中內(nèi)毒素的檢測和控制顯得尤為重要。除去上述各類研究外，研究人員在細菌內(nèi)毒素檢查方法方面也傾入了很大的心血，譬如常見的檢測方法主要有家兔法、鱟試劑法、微量凝膠法以及重組C因子法。但是諸多檢測方法也存在或多或少的缺陷，例如家兔法不能定量檢測熱原、使用動物實驗檢測周期長、靈敏度低等，因此，家兔法正在逐步被取代，而微量凝膠法也存在假陽性太高的缺陷[34]。目前鱟試劑法以靈敏度高、操作簡易而最常用，但是隨著環(huán)境的惡化以及過度捕殺，中華鱟和圓尾鱟已經(jīng)成為瀕危生物，所以急需內(nèi)毒素檢測代替方法進行彌補[12]。相信在眾多研究者的努力下定能力克萬難，為保障生物制劑安全再添濃墨重彩的一筆。