miR-34c在急性腦梗死患者血清中的表達

駱嵩 屈洪黨 劉曉林 許娟娟 馬博 李理 劉東亮 郝佳妮 劉楚楚

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

缺血性腦卒中已經(jīng)成為全球范圍的第一大死亡病因，其高致殘率和高死亡率給家庭和社會都帶來了沉重的負擔〔1，2〕。近年來，微小RNA(miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類重要的非編碼RNA(一般為18～25個核苷酸)。研究證實，miRNA家族廣泛存在于生物體中，并發(fā)現(xiàn)其參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、炎癥反應等諸多疾病的發(fā)生〔3～6〕。在小鼠神經(jīng)根痛的炎癥反應動物模型中，發(fā)現(xiàn)miR-34c具有減輕炎癥反應，緩解神經(jīng)根痛的作用〔7〕。以往的研究主要是觀察miR-34c調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、AD炎癥反應的調(diào)節(jié)作用，在急性腦梗死炎癥反應調(diào)節(jié)中的作用卻鮮有報道。本文通過檢測急性腦梗死患者外周血腫miR-34c表達水平，分析其與炎癥反應指標的關系，為進一步尋找治療急性腦梗死新靶點提供新的思路和線索。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2019年1月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的20例急性腦梗死患者為梗死組，男13例(65%)，女7例(35%)，平均年齡(62.35±5.81)歲；高血壓5例(25%)，高脂血癥4例(20%)，糖尿病2例(10%)，吸煙者6例(30%)，飲酒者5例(25%)；另外健康體檢者20例(正常組)，男14例(70%)，女6例(30%)，平均年齡(61.22±4.32)歲，高血壓4例(20%)，高脂血癥3例(15%)，糖尿病1例(5%)，吸煙者2例(10%)，飲酒者3例(15%)。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準：①符合急性腦梗死診斷標準〔8〕，且在磁共振成像(MRI)上證實與本次臨床癥狀相關的新發(fā)梗死；②腦梗死患者發(fā)病3 d內(nèi)，完善相關外周血等檢驗；③性別不限，美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評分在4～20分；④相關檢驗檢查獲得患者或者法定直系家屬知情同意。排除標準：生命體征不穩(wěn)定、幽閉綜合征等不能配合影像學檢查的疾病；臨床資料不完整；本研究獲得蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2外周血采集及炎癥指標 采集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml，并將其置于不含抗凝劑的試管內(nèi)。室溫下自然凝聚30～60 min，待血液凝固后，以2 000～3 000 r/min的速度離心5～10 min，上清液即為血清，保存在-80℃冰箱。炎癥指標如血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿酸(UA)、C反應蛋白(CRP)含量。

1.3實時熒光定量(RT)-PCR法檢測血清中miR-34c水平 采用RT-PCR法檢測血清中miR-34c表達水平，U6 RNA 引物(內(nèi)參照引物)和miR-34c 莖環(huán)引物均購自上海百力格生物科技有限公司，基因表達相對量用2-△△Ct法進行分析。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1兩組miR-34c表達水平 與正常組相比，梗死組外周血中的miR-34c表達水平顯著下降(1.12±0.02 vs 0.65±0.07；P<0.05)。

2.2miR-34c與炎性指標關系 正常組LDL-C平均(2.17±0.22)mmol/L，UA平均(278.54±15.61)μmol/L，CRP平均(1.40±0.26)mg/L；神經(jīng)功能無缺損。兩組血清LDL-C、UA、CRP比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。梗死組LDL-C平均(2.66±1.00)mmol/L，UA平均(434.89±61.78)mmol/L,CRP平均(5.54±4.91)mg/L，入院時NIHSS平均(10.14±4.07)分。急性腦梗死患者外周血miR-34c與血清LDL-C、UA、CRP呈負相關關系(r=-0.672、-0.629、-0.723；P=0.043、0.038、0.041)；與入院時NIHSS呈負相關關系(r=-0.562,P=0.046)。

3 討 論

急性腦梗死已經(jīng)取代心血管疾病成為我國最常見的死亡病因〔1，2〕，目前的治療主要是及時進行責任血管再通，促進缺血組織的再灌注，但與此同時，缺血缺氧下小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應和再灌注炎性損傷等都直接影響到腦梗死患者的臨床預后。目前研究證實，在缺血半暗帶區(qū)域同樣存在著“炎癥半暗帶”〔9～11〕，因此如何有效調(diào)節(jié)梗死后的炎癥反應，減輕其對組織，尤其是缺血半暗帶組織的繼發(fā)性損傷尤為重要。近年來研究顯示，神經(jīng)系統(tǒng)中的miRNA在炎癥反應過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，表明其參與急性腦梗死的炎癥反應過程〔12，13〕。而以往在對神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，如AD研究中，發(fā)現(xiàn)miR-34c可以調(diào)節(jié)M1型小膠質(zhì)細胞凋亡，減輕炎癥反應〔14～18〕；此外，在慢性神經(jīng)縮窄性損傷的小鼠模型中，miR-34c可以靶向調(diào)控含Pyrin結構域NOD樣受體家族(NLRP)3炎性小體的活化，進而改善神經(jīng)痛癥狀〔7〕。隨著生物學技術不斷發(fā)展，這些miRNA在腦梗死發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)功能不斷得到發(fā)現(xiàn)和闡明，有望成為治療腦梗死的新靶點。

急性腦梗死組織損傷中，炎癥反應占有十分重要的地位。LDL是發(fā)生動脈粥樣硬化的危險重要因素之一，其經(jīng)化學修飾作用后，易和清道夫受體結合，被巨噬細胞攝取，形成泡沫細胞，并停留于血管壁，不斷促使動脈壁形成斑塊；而CRP是細菌和嚴重組織損傷的一項非特異性指標。其也是機體固有免疫機制的一部分，可激活補體，增強和促進淋巴細胞、巨噬細胞生成活化等；UA是核蛋白和核酸中嘌呤分解代謝的最終產(chǎn)物，當生成增多時，相應的氧自由基生成增多，從而加劇炎癥反應，因此UA增高提示缺血缺氧腦組織炎癥反應的劇烈〔19〕。這些炎癥指標均提示炎癥反應發(fā)生，本研究進一步提示炎癥反應在腦梗死的發(fā)病過程中起到重要的作用。

本研究提示miR-34c可能具有減輕炎癥反應的作用；miR-34c外周血表達水平對于評估急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度有著重要的臨床意義。

綜上，外周血miR-34c表達水平的測定，對于評估腦梗死患者危重程度及炎癥反應程度等具有一定的參考價值，但由于研究樣本數(shù)量較少，且為單中心，使得該研究可能存在偏差，因此在后續(xù)的研究中，我們將進一步擴大樣本，并進一步深入到細胞水平研究miR-34c調(diào)節(jié)炎癥反應的機制。