青少年賽艇運動員有氧耐力訓練的代謝應答特征

高 歡，孟志軍，李 濤，梁世雷，王玉新，高炳宏*

青少年階段是人體生長發育的關鍵時期。在這一階段，激素水平急劇變化，第二性征凸顯，身高快速增長。一般認為，14歲之前應注重柔韌性、靈敏性、協調性、動作頻率等身體素質的全方位發展，14歲之后專項化訓練方可逐漸增多（Bompa，1999）。過早、過多的專項化訓練易導致傷病增多（Seiler et al.，2006）。一項針對德國青年賽艇隊的年度訓練負荷結構調查顯示，年度訓練中低強度有氧訓練的比例約為95%，賽前訓練階段最大攝氧量（O2max）及以上強度訓練增加至約5%（Guellich et al.，2009）。六奪奧運金牌的挪威越野滑雪運動員Bente Skari 20歲時90%的訓練內容為有氧耐力訓練，即使是成年后巔峰時期速度訓練也僅占1%（Solli et al.，2017）。體能占主導的項目，一個大周期的訓練計劃中，低強度有氧訓練和無氧閾及以上強度訓練占比分別為80%和20%為宜（Seiler，2010；St?ggl et al.，2015）。美國游泳協會建議，14～18歲的高水平運動員每周安排8～10次、每次持續90～120 min（Riewald er al.，2015）訓練。美國運動員協會指出，青少年階段應注重有氧耐力訓練、控制大強度訓練課的比例以減少損傷（Valovich McLeod et al.，2011）。

青少年運動員年度訓練中較多的進行有氧耐力訓練有助于專項技術的完善和身體素質的全面發展，減少傷病及成年后運動水平的持續提高。階段性有氧耐力訓練后的適應表現為O2max和心輸出量提高（Arbab-Zadeh et al.，2014；Montero et al.，2015），骨骼肌有氧代謝能力增強（Hoppeler et al.，1973；Jacobs et al.，2013；MacInnis et al.，2017），但鮮見其代謝應答機制的研究，尤其是以青少年運動員為對象的訓練實踐研究更是鮮有報道。代謝組學是系統生物學研究的常用手段，其通過全景式的掃描生物體受到刺激或擾動前后的尿樣、血樣、其他體液或組織樣本，理論上可一次獲得所有低分子量代謝產物的信息，可全面地分析干預前后機體代謝功能所發生的變化，不需要預先設定研究指標。近十年，代謝組學已迅速發展并應用到多個領域，在疾病早期診斷的標志物篩選和藥效綜合評價等與人類健康密切相關的領域開展了廣泛的應用研究，在運動科學中的應用僅是初期階段。Nieman應用代謝組學技術發現運動員3天的大負荷訓練后75種代謝物升高2倍以上，其中22種與脂代謝有關，13種與氨基酸代謝有關（Nieman et al.，2013）。新近一項綜合應用多組學技術的研究發現，16天5 260 m高原低氧暴露后骨骼肌傾向于更多地利用磷酸戊糖和單碳底物氧化供能（Chicco et al.，2018）。

賽艇是典型的體能占主導的周期性項目。通常，青少年賽艇運動員冬訓初期主要訓練內容中有氧耐力訓練占比較高。以青少年賽艇運動員為研究對象，在年度冬訓初期一個中周期訓練階段前中后分別收集血樣，借助代謝組學技術篩選差異性代謝物，并結合身體成分、運動能力的變化，分析青少年運動員歷經4周低強度有氧耐力訓練后代謝的綜合應答特征，初步探索其可能適應機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

青少年男子賽艇運動員8名，年齡16.18±1.34歲，身高 188.25±6.18 cm，體質量 78.69±13.38 kg，訓練年限1.5～3.0年。

1.2 主要訓練負荷安排

選擇冬訓初期為研究時間點，以完善技術、發展有氧耐力為研究目的。訓練負荷強度按血乳酸濃度（blood lactate，BLa）分為3類（Seiler et al.，2006）。4周訓練（表1）過程中，每周安排10～12次課；周三下午休息0.5天，周六下午至周日休息1.5天；每周進行2次以徒手力量為主的陸上力量訓練，包括熱身、放松，每次課持續90～120 min。在4周訓練過程中，運動員保持之前的飲食習慣，不使用運動營養品。

表1 訓練負荷結構安排Table 1 Weekly Training Load During 4-week Training

1.3 指標與儀器

分別在4周有氧耐力訓練前后，按Bod Pod標準流程測量身體成分。

以賽艇測功儀（Concept 2，美國）多級遞增負荷測試評價運動能力的變化。測試開始前慢跑10 min、慢走5 min、安靜休息10 min，之后開始正式測試。每級持續4 min，速度要求依次為 01：56.00-01：52.00-01：48.00-01：44.00/500 m，每級間歇30 s，并在此30 s內采耳垂血20 μL測量 BLa（EKF Biosen C_Line，德國）。

4周訓練前后、訓練2周結束調整休息1天后（周一），采晨起空腹肘靜脈血5 ml，肝素鈉抗凝，3 500 rpm離心15 min，分離血漿，-80℃凍存待測。以LC-MS/MS平臺（1290 Infinity LC，Agilent Technologies，美國；AB Sciex TripleTOF 6600，美國）分析4周有氧耐力訓練過程中血漿代謝譜的差異，按標準流程建模，以VIP＞1且P＜0.05為標準，并與HMDB、Metlin數據庫比對，篩選、確定差異代謝物。以Hitachi L-8900定量分析血漿游離氨基酸濃度的變化。

1.4 數理統計

4周訓練前后體質量、身體成分以配對t檢驗（雙尾）比較。多級遞增負荷測試不同時間點BLa和4周訓練前中后血漿游離氨基酸各時間點差異以重復測量方差分析比較。以PCA、PLS-DA、OPLS-DA建模確定血漿差異代謝物。P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有極顯著差異，0.05＜P＜0.10為具有顯著性差異的趨勢。

2 研究結果

2.1 4周有氧耐力訓練前后身體成分的變化

4周有氧耐力訓練后，體質量、脂肪質量及體脂含量均下降，去脂體質量略有增加，但均無統計學意義（表2）。

表2 4周有氧耐力訓練前后身體成分的變化Table 2 Change of Body Composition before and after 4-week Aerobic Training

2.2 4周有氧耐力訓練前后運動能力的變化

與訓練前比較（圖1），4周有氧耐力訓練后多級遞增負荷測試各級血乳酸濃度整體有顯著差異的趨勢（P=0.057），乳酸曲線右移；最后一級結束即刻血乳酸濃度與訓練前比較有顯著差異的趨勢（P=0.056）；運動結束后5 min（5’R）時血乳酸濃度顯著低于訓練前（P=0.009）。

圖1 多級遞增負荷測試BLa的變化Figure 1.Comparison of Blood Lactate in Incremental Intensity Test before and after 4-week Aerobic Training

2.3 4周有氧耐力訓練過程中血漿代謝譜的變化

2.3.1 基于LC-MS/MS的血漿差異性代謝物

有氧耐力訓練2周后與訓練前相比較，血漿差異代謝物為31種，分屬于核苷酸、脂肪酸、肉堿、溶血磷脂膽堿、磷酰膽堿和氨基酸等多個類型。其中，血漿腺苷、肌苷分別較訓練前升高約76.9倍、10.9倍，次黃嘌呤升高約3.9倍，尿苷、尿嘧啶升高約1.6倍，煙酰胺升高約3.2倍。膽堿、多種類型的溶血磷脂膽堿和磷酰膽堿均顯著升高；十五烷酸（C15）顯著升高，而辛酸（C8）顯著降低；兩種類型的酰基肉堿硬脂酰肉堿（C18）和2-甲基丁酰肉堿（C5）均顯著升高；多種生糖氨基酸水平顯著升高，N-乙酰丙氨酸顯著下降約9.3倍（表3）。有氧耐力訓練4周后，多數代謝物升高幅度降低或較訓練前下降，血漿ADO、INO、HX下降至訓練前約1.5倍、2.2倍。

有氧耐力訓練2周后差異代謝物富集的信號通路主要有甜菜堿代謝、支鏈氨基酸降解代謝、磷脂生物合成、β-丙氨酸代謝、甲基組氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、甲硫氨酸代謝、膽汁酸生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸代謝、苯乙酸酯代謝和嘌呤代謝等（圖2）。

2.3.2 4周有氧耐力訓練過程中血漿游離氨基酸的變化

重復測量方差分析顯示，Val、Leu、Gly、Glu濃度間點存在顯著差異（P=0.019、P=0.030、P=0.023、P=0.007），Ala有顯著差異的趨勢（P=0.078）。與訓練前相比，訓練后血漿中上述游離氨基酸濃度均顯著升高；訓練中與訓練前相比，血漿游離Val、Leu、Ala均顯著升高，Glu有顯著升高的趨勢（圖3）。

3 分析與討論

青少年賽艇運動員經歷4周的有氧耐力訓練后，體質量下降約1%，去脂體質量升高約1%，身體脂肪質量減少約9%，但均未發生統計學意義上的顯著變化；多級遞增負荷測試發現乳酸-功率曲線整體右移，恢復5 min后BLa顯著降低，提示有氧運動能力得到改善。基于LCMS/MS的血漿代謝譜分析發現，有氧耐力訓練2周后多種類型的核苷酸、氨基酸、脂肪酸、溶血磷脂酰膽堿、酰基肉堿發生了顯著改變。其中，血漿ADO升高70余倍，INO升高10余倍。差異代謝物富集于甜菜堿代謝、支鏈氨基酸降解代謝、磷脂生物合成、β-丙氨酸代謝、甲基組氨酸代謝、谷胱甘肽代謝等代謝通路。

ADO、INO、HX均屬于嘌呤類代謝物，終產物均為尿酸（Fumagalli et al.，2017）。運動可引起骨骼肌和其他組織ATP降解增多。ATP在一系列酶促反應作用下依次降解生成ADO、INO、HX，并釋放進入循環血中。安靜狀態下血漿中約2/3的嘌呤從尿排出，部分合成尿酸從腸道排出（Hellsten-Westing et al.，1994；Sorensen et al.，1975；Stathis et al.，1999；Sutton et al.，1980）。運動對循環血各類型嘌呤代謝物的影響與運動負荷強度和持續時間有關。持續較短時間的低強度運動，如不到10 min的低強度有氧運動后即刻血漿ADO升高（Guieu et al.，2015）；持續30 min 70%HRmax或70%O2max中等強度有氧運動后3 h，血漿HX、XAN仍顯著高于運動前3～4倍（Kaya et al.，2006；Moritz et al.，2017）；強度更大的急性沖刺運動后血漿INO、HX和尿酸均升高，至結束后24 h仍未能恢復（Stathis et al.，2006）。但系統運動訓練有助于減輕大強度運動引起的血漿嘌呤代謝物升高幅度（Dudzinska et al.，2018；Stathis et al.，2006）。動物模型的研究證實，規律的中等強度有氧運動6周后ATP、ADP、AMP水解顯著減少（Cardoso et al.，2012）。攝入外源性ADO和AMP后骨骼肌糖脂氧化能力增強，胰島素敏感性升高（Ardiansyah et al.，2018）。運動導致ADO的快速升高及其受體激活后所發揮的抗炎作用，有助于緩解缺氧缺血給組織帶來的氧化損傷，抑制淋巴細胞增殖，緩解免疫抑制（Haskó et al.，2004，2008；Moritz et al.，2017）。以上分析表明，運動強度越大，持續時間越長，ADO、INO等升高幅度越大；系統訓練有助于減輕同負荷運動時嘌呤核苷酸的降解；ADO、INO等一系列嘌呤代謝物的升高有助于機體應對運動所致的應激。本研究中青少年賽艇運動員有氧耐力訓練2周后，血漿ADO、INO、HX均大幅升高，尤其是ADO較訓練前升高70余倍，INO升高10余倍，而4周后升高幅度下降，表明冬訓初期連續2周以中低強度有氧為主的系統訓練仍造成了較強的代謝應激，運動員可能對訓練負荷仍不適應；高ADO、INO、HX水平可能是機體啟動各方面應激機制、修復應激損傷一種分子信號。

肉堿主要負責將活化的脂肪酸（脂酰CoA）轉運進入線粒體基質內進行β-氧化。脂酰CoA上的CoA在肉堿酰基轉位酶的作用下生成脂酰肉堿。血漿中的酰基肉堿可在一定程度上反映線粒體內的酰基CoA水平（Kler et al.，1991）。當脂肪動員增多或膳食攝入脂肪過多，線粒體基質中的酰基CoA可在轉位酶的作用下轉變為酰基肉堿釋放入循環血（Koves et al.，2008；Millington et al.，2011；Violante et al.，2013）。血漿中酰基肉堿水平升高可能與脂肪酸動員增多、骨骼肌脂肪酸β-氧化不完全有關（Koves et al.，2008）。研究發現，補充乙酰肉堿可減輕低氧應激和腦部神經元損傷，抑制細胞凋亡（Barhwal et al.，2007；Hota et al.，2012；Zhang et al.，2010）。L-肉堿和丙酰-L-肉堿具有加快脂肪酸氧化利用和抗氧化損傷作用，臨床上也作為治療心血管疾病用藥（Ferrari et al.，2010；Lango et al.，2001；Vanella et al.，2000）。運動員大強度訓練后補充L-肉堿有助于減輕運動性缺氧和骨骼肌損傷（Fielding et al.，2018）。以上研究提示，循環血中酰基肉堿濃度升高可能與脂肪動員增多有關，高濃度酰基肉堿可能促進脂肪酸氧化供能，同時，一些短鏈酰基肉堿表現出的抗氧化損傷作用，也可能有助于加速訓練后的恢復、修復氧化應激損傷。本研究中有氧耐力訓練4周后身體脂肪質量減少約9%，2周的有氧耐力訓練后空腹安靜狀態下循環血中硬脂酰肉堿、2-甲基丁酰肉堿均顯著升高，4周后有所恢復，提示有氧耐力訓練后安靜狀態下運動員脂肪動員和脂肪酸氧化增多，以滿足機體恢復所需的能量、修復各種應激損傷；但2周耐力訓練后血漿長鏈脂肪酸（十五烷酸）升高，而短鏈脂肪酸（辛酸）下降，這可能與剛開始系統訓練時三羧酸循環與轉運進入的脂肪酸氧化效率不匹配，酰基肉堿反向跨膜進入循環血增多有關。

lysoPCs和PCs都是甘油磷脂類家族成員，lysoPCs同時也是PCs生物合成的重要中間體，具有豐富的生物活性。PCs還是細胞膜、血漿脂蛋白、膽汁的重要組成，PCs經磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、磷脂酶A1水解及HDL經內皮脂肪酶水解是血漿LysoPC的重要來源（Gauster et al.，2005），健康普通人血漿中的lysoPCs濃度一般為 200～400 μmol/L（Kuliszkiewiczjanus et al.，2005；Süllentrop et al.，2002）。炎癥是引起循環血中 lysoPCs降低的原因之一（Drobnik et al.，2003），重癥膿毒癥患者血漿CRP與lysoPCs呈顯著負相關（Taylor et al.，2007）。小鼠注射lysoPCs后表現出抗炎作用，TNF-α和IL-1β降低（Yan et al.，2004）。本研究中，有著較強抗炎癥和DNA修復作用的煙酰胺也顯著升高，或間接印證了這一點。低lysoPC 18：2是老年人步速下降的獨立預測因子（Gonza‐lez-Freire et al.，2019）。lysoPC可作為配體與特異性G蛋白藕聯受體結合，生成溶血磷脂酸，后經特異性受體調控細胞的增殖和分化（Aikawa et al.，2015）。溶血磷脂酸也可經一系列酶促反應合成心磷脂，進而調控線粒體電子傳遞鏈效率（Paradies et al.，2014；Pennington et al.，2017）。研究表明，血漿低lysoPCs水平與骨骼肌線粒體氧化能力下降有關（Semba et al.，2019）。運動訓練對循環血PCs、lysoPCs的影響鮮見報道。本研究發現，2周有氧耐力訓練后安靜狀態下血漿中多種PCs、lysoPCs顯著升高，同時，4周有氧耐力訓練后去脂體質量增加，脂肪質量減少，循環血中高lysoPCs可能是抗炎能力增強、骨骼肌有氧氧化能力改善的表現。

膽堿是PC合成的必需分子，也是脂蛋白微粒的重要組成。血漿高膽堿水平有利于脂肪酸的轉運（Konstanti‐nova et al.，2008）。膽堿還可在腸道菌群被分解為三甲胺，再經肝腸循環在肝臟合成氧化型三甲胺，參與糖脂代謝的調節（Bennett et al.，2013；Wang et al.，2016）。鵝脫氧甘膽酸鹽是眾多膽汁酸鹽的一種，可調節肝臟、腸道對糖、脂肪和膽固醇的吸收利用（Dawson et al.，2015；Hy‐lemon et al.，2009）。本研究中青少年運動員有氧耐力訓練2周后血漿膽堿和與腸道菌群功能相關的代謝物如ILA（表3）、瓜氨酸濃度顯著升高，提示青少年運動員有氧耐力訓練后肝臟和腸道菌群功能可能發生了顯著改變。

本研究基于LC-MS/MS的非靶向代謝組學比較分析發現，2周有氧耐力訓練后血漿Val、Leu、Ile和其他數種生糖氨基酸如Phe、Try、Glu、Met以及牛磺酸、焦谷氨酸、N-乙酰丙氨酸發生了顯著改變。差異代謝物主要富集于甜菜堿代謝、支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）降解、β-丙氨酸代謝、甲基組氨酸代謝等涉及氨基酸代謝的信號通路（圖2）。經靶向定量測量驗證，4周有氧耐力訓練后血漿Val、Leu、Gly、Ala、Glu濃度顯著升高（圖3）。

BCAA在骨骼肌中含量豐富，可作為骨骼肌和免疫細胞的能源底物（Negro et al.，2008；Shimomura et al.，2004）；補充BCAA可提高NK細胞活性和中性粒細胞吞噬功能（Kephart et al.，2016；Nakamura，2014），有助于大負荷運動后免疫功能的維持（Kephart et al.，2016）。適量攝入BCAA還可加快運動員大力量訓練后肌肉疲勞的恢復（Waldron et al.，2017），訓練前補充BCAA在緩解肌肉酸痛方面的效果比訓練后補充更好（Ra et al.，2018）。血漿Glu大部分被骨骼肌吸收利用（Hediger et al.，1999；Klin et al.，2010）。Glu在丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotrans‐ferase，ALT）的作用下可生成Ala和2-酮戊二酸，以回補途徑參與TCA循環氧化供能（Owen et al.，2002）。Ala還可經“葡萄糖-丙氨酸循環”在肝臟和骨骼肌中參與氧化供能（許豪文，2001）。運動訓練可引起ALT顯著升高（Leibowitz et al.，2012）。本研究證實，4周有氧耐力訓練后Glu、Ala均顯著升高，這可能與4周系統訓練后肝臟釋放Glu增多、骨骼肌ALT活性升高有關。Val、Ile、Glu、Gly、Ala都是生糖氨基酸，可異生為葡萄糖參與氧化供能（鄭集等，2007）。游離氨基酸可作為信號分子，經特異性受體或經ERK、mTOR等經典信號通路參與細胞自噬來調節蛋白質的降解（Kadowaki et al.，2003）。研究還發現，差異代謝物富集的通路多個涉及氨基酸代謝，包括甜菜堿代謝、甲基組氨酸代謝等。甜菜堿又稱為三甲基甘氨酸，可由膽堿在肝臟和腎臟中合成；甜菜堿代謝通路中的中間代謝物可參與肉堿的合成，可激活運動中和運動后生長激素和胰島素樣生長因子-1的分泌來促進骨骼肌蛋白質的合成，并促進脂肪酸氧化（Cholewa et al.，2014）。甲基組氨酸代謝的關鍵代謝物3-甲基組氨酸是判斷骨骼肌分解代謝程度的標志物，力量訓練后尿3-甲基組氨酸濃度顯著升高（Pivarnik et al.，1989），其中間產物β-丙氨酸可促進骨骼肌線粒體生物合成（Schnuck et al.，2016），也參與其他多個代謝途徑。本研究中多種游離氨基酸濃度的升高可能與系統的有氧耐力訓練后能量代謝重編程，一系列代謝通路被激活或發生了顯著改變有關，發現4周有氧耐力訓練后血漿BCAA、Glu、Gly、Ala較訓練前大幅升高，去脂體重小幅增加，脂肪質量減少，有氧能力改善，這可能是骨骼肌蛋白質合成增多，氨基酸糖異生能力增強的表現。青少年賽艇運動員對有氧耐力訓練的代謝應答涉及到多個氨基酸代謝通路，其中Val、Leu、Gly、Ala、Glu等在有氧耐力訓練適應中的作用及其機制值得今后進一步開展深入研究。

4 結論與不足

4.1 結論

青少年賽艇運動員4周有氧耐力訓練后有氧運動能力改善，身體脂肪質量降低，去脂體質量小幅增加；伴隨著核苷酸降解增多、脂肪動員和脂肪酸轉運加強以及肝腸代謝功能改變；經非靶向代謝組學分析并靶向驗證發現，支鏈氨基酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等生糖氨基酸在青少年賽艇運動員有氧耐力訓練的代謝應答中有著重要作用。血漿腺苷、肌苷等具有較高VIP值、發生較大幅度變化的代謝物是判斷青少年賽艇運動員有氧耐力訓練代謝應答與適應效果的潛在標志物。

4.2 不足

研究也存在一些不足：一是受運動隊客觀條件限制，未能設置條件相近的不訓練對照組；二是在研究過程中未詳細記錄每日膳食種類和數量；三是所發現的差異代謝物的生物學作用尚需進一步驗證和闡釋。