工業廢棄合成氣厭氧發酵產己醇研究進展

張存勝，劉巖，楊莉，田玉菲

（1 江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013；2 江蘇省生物質能源與材料重點實驗室,江蘇南京210042；3 南京智造力知識產權代理有限公司，江蘇南京211100）

乙醇在汽油中的推廣使用，使得生物丁醇和生物己醇研究備受關注。作為中鏈醇，己醇具有高能量密度、低水溶性、低揮發性等特點，可與汽油混合作為燃料使用；在醫藥化工領域，己醇也是許多產品的重要前體原料[1]。目前己醇主要由化學法制備，即Ziegler生產途徑[2]，其反應式如式(1)～(4)。

由于化工合成途徑對環境污染較大，尋求廉價、綠色的己醇合成方法十分緊迫。利用微生物發酵合成生物醇類是一項極具前景的綠色技術，它可以通過微生物發酵將原料轉化為相應的醇，避免化工途徑產生的重污染。生物乙醇是生物法合成醇類的典型案例，批式發酵時乙醇濃度可高達100g/L[3]。與生物乙醇相比，生物己醇發酵技術尚不成熟。工業廢棄合成氣是目前報道最多的己醇發酵原料之一，其用于己醇發酵具有抑制物少、成本低等優勢，但也存在諸多問題，如反應速率慢、產量低、氣液傳質效率低等[4]。本文結合近幾年的生物己醇研究進展，對合成氣制備生物己醇的研究進行了綜述，分別介紹了己醇合成的幾種微生物及相關原理，討論了影響合成氣己醇發酵的關鍵因素，并對己醇的發酵策略進行了論述，最后對生物己醇的發展前景進行了展望，旨為己醇生物合成研究提供思路，以期生物己醇用于工業生產。

1 己醇發酵微生物及代謝原理

目前報道中，生物己醇的合成有兩種途徑，一是利用單一菌株直接將合成氣轉化為己醇，能夠實現該轉化的菌僅有Clostridium carboxidivorans[4]，其代謝原理如圖1所示。代謝途徑分為甲基途徑和羰基途徑兩個分支，兩個分支將氣態底物轉為中間產物乙酰輔酶A（acetyl-CoA），乙酰輔酶A在不同酶的作用下有3 個轉化方向：①生成乙酸和乙醇（Wood-Ljungdahl 途徑）；②通過丁酰輔酶A（butyryl-CoA）生成丁酸和丁醇；③通過己酰輔酶A（hexanoyl-CoA），生成己酸和己醇[5-6]。值得注意的是，在乙酰輔酶A 轉換為己酰輔酶A 的過程中，丁酰輔酶A 通過硫解酶與乙酰輔酶A 作用生成3-氧代己酰輔酶A，進一步轉化為己酰輔酶A，此過程為己醇合成的重要途徑，為鏈延伸過程[7]。通過己酰輔酶A合成己醇有兩種可能的途徑：①醛脫氫酶將己酰輔酶A還原為己醛，己醛通過己醇脫氫酶還原為己醇[8]；②生成的己酸直接被還原為己醇，在此情況下，己酸先由醛氧化還原酶轉化為己醛，然后再由己醇脫氫酶轉化為己醇[9]。

由于能夠直接進行生物己醇合成的微生物極少，一般采用多種微生物混合發酵，通過它們的協同作用制備己醇，是己醇生物合成的可替代途徑。利用不同菌種將合成氣轉化為己醇的過程可分為3個階段，如表1所示，第一步為合成氣向乙酸、乙醇的轉化，即通過Wood-Ljungdahl 途徑將CO、CO2和H2轉化為乙酸和乙醇[10-13]；第二步為乙酸乙醇向己酸的轉化，即乙酸乙醇通過鏈延伸作用合成中鏈己酸[14]；第三步為己酸向其對應醇的轉化，即己酸還原為己醇[15-16]。

由表1不難發現，除C.carboxidivorans外，其他菌株均不能獨立完成合成氣向己醇的轉化。利用不同功能的微生物混合發酵，基于它們的協同作用，為己醇的轉化提供了可能。Diender等[18]以合成氣為原料，將C.autoethanogenum 和C.kluyveri 進行混合培養，發現發酵產物中有己醇生成，兩株菌在發酵過程中產生了協同作用，其中C.autoethanogenum將合成氣轉化為乙酸和乙醇，而C.kluyver 通過反向β氧化將乙酸乙醇轉化為己酸，C.autoethanogenum利用合成氣將己酸還原為己醇。無獨有偶，Richter等[19]將C.ljungdahlii和C.kluyveri進行混合發酵，實現了合成氣向己醇轉化。

圖1 Clostridium carboxidivorans合成己醇代謝途徑

表1 合成氣轉化為己醇的功能菌株

相比而言，合成氣向乙酸乙醇和己酸的轉化技術已取得顯著進展[10-14]，然而，己酸還原為己醇的研究尚未有明顯突破。新近研究發現，一些菌株能夠利用合成氣將羧酸還原為相應的醇，如Clostridium ragsdalei、C.ljungdahlii、Alkalibaculum.bacchi 和C. carboxidivorans 等[15-16]。Liu 等[16]研 究 發現，A. bacchi CP15 單一培養時己酸轉化率僅為63.6%，而Alkalibaculum bacchi CP15 與Clostridium propionicum 混合發酵時己酸轉化率高達90.7%。這表明將兩種或多種菌種混合培養，能夠實現己醇的連續轉化。

2 提高合成氣己醇發酵效率的措施

2.1 合成氣組分調控

合成氣中CO、H2和CO2的體積分數分別為1%～59%、2%～34%和10%～15%[20]。CO 和H2是合成氣發酵中微生物主要的碳源和電子來源，CO2只能在CO 或H2存在的情況下作為碳源使用[21]。適宜濃度的CO 可以促進細胞的生長和乙醇的產生，有研究表明，在H2/CO比為0.36時，發酵得到的最大乙醇/乙酸比僅為0.06，而H2/CO比為1.2時，乙醇/乙酸比可達2.5[16]，因此為了增加醇的產量，可適當地提高合成氣組分中CO 的濃度。但過高的CO濃度會抑制微生物氫化酶的活性，例如混合氣體中CO 體積分數為10%時，其對C.ragsdalei 氫化酶活性的抑制率高達90%[22]。當氫化酶的活性被抑制時，微生物將通過一氧化碳脫氫酶（CODH）氧化CO 獲得電子，此時醇的轉化率將會降低，這是由于CO 被用于交換電子而非物質轉化[23]。因此，為了獲得較高的碳轉化率和高己醇產量，應控制合成氣中CO濃度，避免其對氫化酶產生抑制作用。

2.2 抑制物控制

除CO、H2、CO2外，合成氣還含有許多微量化合物，用于己醇發酵時，會嚴重影響微生物的生長和代謝[24]。例如，NO 的摩爾分數大于0.015%時會明顯抑制C.carboxidivorans P7氫化酶的活性，使氫化酶分解H2產生電子受到抑制[23]。氨是可能出現在合成氣中的另一抑制物，Xu 等[25]研究發現，氨的存在會導致培養基中銨離子（N）的積累，從而抑制了氫化酶活性和細菌的生長，氨的摩爾分數為0.37% 時就會對C. ragsdalei 產生明顯的抑制。Zhang 等[26]通過高濃度氨氮進行了己酸發酵，發現C.kluyveri 游離細胞對氨氮的耐受極限值是2.0g/L，采用秸稈對該菌進行固定化培養后發現，固定細胞對氨氮的耐受性顯著提高，氨氮濃度達5.0g/L時該菌仍可進行己酸轉化，這表明通過細胞固定手段可以提高微生物對抑制物的抵抗能力。因此，在利用工業廢棄合成氣進行發酵時，一方面需提高微生物的耐受性，另一方面可去除合成氣中雜質，以提高發酵的穩定性、降低其對發酵的負面影響。

2.3 氣液傳質效率提高

CO 和H2在水相中的溶解度均較低，雖然其可為己醇發酵提供碳源和能源，但由于氣液傳質的限制，降低了氣體利用率、限制了溶劑產量[27]。許多研究對不同的反應器進行了探索研究以增強氣液傳質效率，如連續攪拌釜式反應器（CSTR）、中空纖維膜反應器（HFMR）、泡柱反應器、氣升式生物反應器等。其中，CSTR 通過葉輪攪拌可提高氣體與液體的接觸面積促進氣液傳質，且易于操作和控制，是目前最常用的反應器[28]。在HMFR中，氣態底物流經中空纖維膜的管腔，通過微孔膜擴散而不形成氣泡，微生物在中空纖維膜的另一側生長、形成生物被膜，能夠快速吸收擴散過來的氣體，有效提高傳質效率[29]。

另有研究表明，在發酵培養基中添加活性炭和納米顆粒等固定化載體能提高氣液接觸面積和傳質效率。Lee 等[30]研究了磁性二氧化硅納米顆粒對合成氣發酵過程中CO、H2和CO2溶解度、細胞質量、醇和酸產量的影響。研究發現，與對照組相比，實驗組能將CO、H2和CO2的溶解量分別提高3.15倍、2.94倍和0.97倍，將乙醇、乙酸濃度和細胞質量分別提高2.14 倍、0.6 倍和2.28 倍，其機理在于穩定的納米顆粒與氣泡相互碰撞使氣泡破碎變小，增加了傳質面積[31]。

CO、H2或CO2等氣體的溶解度與壓力成正相關的線性關系，高壓可改善傳質、促進培養基中底物更好的供應，并增加細胞對碳源和能量的利用，從而獲得更高的生長速率和產物濃度[28]。Abubackar等[32]比較了不同初始壓力對C.autoethanogenum發酵產乙醇的影響，發現高壓環境會促使乙醇產量增加，這是由于高壓對氣體的溶解度和生物轉化效率產生了積極的影響。

2.4 溫度與pH調控

溫度與pH 是影響發酵效率的重要環境因子，它們會直接影響細胞活性、生長速度甚至代謝途徑。多數微生物發酵適合在30～37℃中溫下進行。然而最近研究表明，中溫雖有利于酸的積累，但不適合醇類的產出，與37℃相比，若將C.carboxidivorans P7 在25℃的低溫下培養，其代謝活性和生長速度降低、遲滯期延長，但低溫能促使乙醇和丁醇產量提高，分別達到了32.1mmol/L 和14.5mmol/L，對應的己醇和己酸濃度分別為8.21mmol/L 和9.02mmol/L[13]，這表明適宜的低溫環境可促進碳鏈延伸和長鏈酸醇累積。發酵溫度不僅影響微生物的生長和底物轉化，也會影響合成氣在發酵液中的溶解度[28]，低溫環境更利于氣體的溶解。因此，在己醇發酵過程中，可通過調整培養溫度來實現某一目標產物的積累。

C.carboxidivorans生長的pH范圍為4.4～7.0，最佳pH為5.0～7.0[33]。高pH（5.0～6.0）有利于細胞生長和羧酸轉化，低pH（4.5～5.0）有利于醇類物質生成[34-35]。然而，過低的pH 會抑制細菌生長，最終導致細胞死亡。Abubackar 等[36]研究發現，在控制pH 為4.5 的合成氣發酵過程中， C.autoethanogenum中只有乙醇的產量增多。pH為6.0時，發酵體系會積累等量的乙酸和乙醇，這表明pH對微生物利用合成氣具有重要的影響，低pH更有利于溶劑的生成。

2.5 其他措施

金屬元素通常在Wood-Ljungdahl 途徑中與底物結合或影響電子轉移，從而影響產物的積累，增加培養基中特定微量金屬的濃度會提高己醇產量[37]。生產乙醇、丁醇和中鏈醇也需要較低的氧化還原電位，無氧環境對微生物利用合成氣極為重要，在底物中加入還原劑如Na2S 可為微生物提供良好生長環境、提高長鏈醇產量。另外，H2作為還原物質還可提供電子、參與NAD(P)+向NAD(P)H的轉化，有利于醇類物質生成[38]。

3 生物己醇發酵發展前景分析

我國正己醇產量較低，例如2019 年國內正己醇產量約2000 噸。而國內正己醇需求量則日趨增大，預計至2023 年國內己醇需求量將達6400t/a，未來幾年己醇價格將維持在3.9 萬元/噸左右。相比之下，工業廢棄合成氣的價格極為低廉，約0.915CNY/m3。利用廉價合成氣進行己醇高值轉化具有較強的經濟優勢，然而技術瓶頸將合成氣己醇發酵限制在實驗室研究水平。目前，利用廉價合成氣發酵制備乙醇已在多地投產應用，例如，朗澤技術（Lanza Tech）公司與中國首鋼集團啟動了全球首個將工業廢氣轉化為乙醇的商業化設施[29]，生物乙醇生產顯示了良好的經濟效益和社會效益[39]。

近年來，研究人員對合成氣發酵的研究主要集中在丁醇生產，對己醇的研究報道較少、且己醇濃度較低，例如，由C.carboxidivorans 利用合成氣制備己醇時最高濃度僅為1.06g/L[4]，未來生物己醇的研究方向將集中在克服低產量的“瓶頸”問題，有望在下列3個方面取得突破。

3.1 構建基因工程菌

Bruant等[40]對C.carboxidivorans的整個基因組進行了測序，經過對比分析，發現C.carboxidivorans具 有 完 整 的 Wood-Ljungdahl 基 因 簇， 且C.carboxidivorans具有能夠編碼己醇脫氫酶的基因，己醇脫氫酶使己酰輔酶A轉換為己醇，目前尚未發現其他梭狀芽孢桿菌具有這種己醇脫氫酶。有研究提出，利用基因組整合可使生成副產物的途徑中止，提高目標產物的產率；或通過合成生物學手段，將Wood-Ljungdahl 途徑的基因移植到更具可塑性的細胞內，以提高己醇產率[41]。目前，Wood-Ljungdahl 途徑的基因已經被成功引入大腸桿菌[42]，隨著基因工程技術進一步發展，此類方法有望實現生物己醇產量突破。

3.2 兩種或兩種以上菌株的混合發酵

對兩株或多株菌混合培養，利用混菌協同作用實現己醇轉化的可行性已被證實。然而，混合發酵仍有諸多問題有待解決。通過調節發酵體系關鍵環境因子，能夠改善微生物生長條件和傳質效率，為己醇產量提高提供可能。例如，C.autoethanogenum和C. kluyveri 的共培養只能在pH 為5.5～6.5 的范圍內進行[20]，對pH 進行實時在線調節能夠同時提高兩株菌的發酵性能。合成氣中的CO對C.kluyveri會產生毒性[19]，適當調節CO 初始濃度可降低CO 對C.kluyveri毒性。為促進微生物與合成氣充分接觸，可開發更為有效的反應器以增大氣液接觸面積、提高氣液傳質效率。

3.3 高產己醇菌篩選

自然界的土壤、厭氧活性污泥及生物質廢水中微生物種類繁多，大多數微生物屬于未培微生物，從自然界篩選高產己醇菌是獲取目標菌株的重要手段。例如，C.carboxidivorans 最初即是從美國俄克拉荷馬州的農業瀉湖中分離獲得[33]，這表明自然界是目標菌株的重要來源。未來的研究需要對篩選培養基進行科學設計，并對所篩選菌株進行馴化等，以獲取高效表達、高耐受性的目標菌株。

4 結語

采用工業廢棄合成氣進行生物己醇合成能夠降低己醇的生產成本，提高其經濟價值，同時又能減少廢氣排放，實現資源利用和環保的雙贏。除合成氣外，許多生物質廢棄物也是生物己醇的良好原料，例如采用混合發酵時，乙醇、乙酸和己酸均可由生物質獲得，這將拓寬生物己醇發酵的原料范圍，為其廣泛應用奠定基礎。目前，生物己醇發酵的瓶頸問題仍然是己醇產量較低，通過基因技術獲取突變株、從自然篩選功能菌和混菌發酵有望在己醇方面取得突破，通過耐受性篩選、關鍵環境因子調控等手段能夠進一步提高己醇發酵性能，為生物己醇的產量提高提供了可能。