一體式厭氧氨氧化反應器常溫運行與微生物群落研究

李云飛,王絲可,2,左劍惡*（.清華大學環境學院,環境模擬與污染控制國家重點聯合實驗室,北京 00084；2.深圳職業技術學院,深圳 58055）

近年來我國水體氮元素污染形勢嚴峻.根據《2015年中國環境統計年報》[1],2015年全國廢水中氨氮排放量為229.9萬t.根據2018年《中國生態環境狀況公報》[2],黃河流域、松花江流域輕度污染,遼河流域中度污染,主要污染指標均包括氨氮,此外,滇池、太湖、巢湖均存在不同程度的氨氮污染.而水環境中氮元素富集會導致水體富營養化,對人體、對水生生物健康產生不利影響.面對水體氮素污染帶來的嚴重危害以及嚴苛的出水水質標準與相關法規,污水脫氮的重要性日益凸顯.基于厭氧氨氧化的新型脫氮工藝比傳統硝化-反硝化工藝曝氣需求低,污泥產量小,且不需額外添加碳源,具有更高的成本效益.因實際污水中往往缺乏厭氧氨氧化反應所需的亞硝酸鹽氮,故需將亞硝化與厭氧氨氧化工藝耦合.

亞硝化-厭氧氨氧化（PNA）工藝的一體式反應器構型具有占地小、便于管理、無高濃度亞硝酸鹽氮積累等優勢,故在側流處理含高濃度氨氮廢水中應用廣泛.目前,全世界已有 100余座工程規模的基于厭氧氨氧化的脫氮裝置用于污水脫氮處理[3].

目前為止,已有諸多針對一體式PNA工藝的研究,旨在明確體系內微生物群落、優化反應器運行條件等.研究表明,一體式 PNA 工藝體系內存在好氧氨氧化菌（AOB）、厭氧氨氧化菌（AnAOB）、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）以及異養菌（HB）,前三者為核心功能微生物.顆粒污泥和生物膜是一體式PNA工藝中常見的污泥形式,均能實現AnAOB和AOB在體系內的持留.使用載體來形成生物膜可以增加體系內持留的生物質總表面積,從而提升工藝容積負荷;常見的AnAOB載體包括沸石、樹脂、無紡布、海綿等[4-6],顆粒污泥具有良好的沉降性能,可使懸浮生長的生物量盡可能降低,并能大幅提升反應器氮去除負荷[7].為實現良好脫氮效果,需對NOB進行抑制,在運行策略方面主要有間歇曝氣、溶解氧調控、維持體系內剩余氨氮濃度等方法[8-13].

一體式PNA工藝已經在側流廢水脫氮中得到了廣泛應用,若將該工藝進一步應用于主流廢水,必能促進污水廠實現能源自給,實現可持續發展.然而,一體式 PNA工藝主流應用還存在諸多挑戰,如工藝脫氮效果隨溫度降低下降,且微生物群落隨之變化.盡管在 30℃左右的條件下,PNA工藝具有在主流條件下實現良好脫氮效果的潛力:新加坡樟宜污水回用廠利用分段進水活性污泥法處理主流廢水,其中62%的總氮是基于PNA原理脫除[14];但在我國多數地區,季節差異使市政污水溫度波動大,最低可能達 10℃及以下,這是 PNA工藝穩定運行最大的壁壘之一.研究表明隨著溫度下降,AnAOB活性會受到明顯抑制[15-16],如溫度從 30℃降低到10℃時AnAOB的活性會降低10倍[17].且溫度對不同微生物的生長和活性的影響不同,溫度降低可能導致 PNA系統內微生物群落變化,從而影響 PNA工藝的運行工況.此前研究表明,單次溫度變化大于 10℃的急劇降溫和單次溫度變化僅為 3℃的小幅降溫均會使系統失穩[18];此外,降溫也可能導致出水硝酸鹽濃度升高等后果[19].因此,針對溫度對一體式 PNA工藝運行的挑戰,本研究首先明確降溫對工藝運行效果的影響,隨后明確體系內微生物活性與群落結構隨溫度的變化,以進一步推動一體式PNA工藝的主流應用.

1 材料與方法

1.1 反應器的常溫運行

1.1.1 試驗裝置 本研究試驗的主體裝置為一體式PNA序批式反應器（SBR）及相關附屬設備.反應器工作體積為 2.2L,排水比恒定為 0.48,外部設一層恒溫水浴套,通過水浴加熱儀來控制水浴溫度,從而使反應器內部水溫保持恒定,實現對運行溫度的調控.反應器中設有一攪拌器,確保除沉淀、出水以外的其他時段反應器中水體和污泥呈完全混合狀態.進水出水分別通過兩臺蠕動泵控制,每個周期進水、出水體積恒定為 1.06L.曝氣通過空氣壓縮機和一個插入反應器內部的黏砂曝氣頭進行,空氣壓縮機與轉子流量計相連接來調控曝氣流量;溶解氧（DO）濃度、水體溫度和pH值通過在線電極實時顯示,以便進行相應控制和調試.反應器的進水、出水、曝氣、沉淀等階段的時間控制由PLC自動控制系統實現.反應器上部設有一取樣口.試驗裝置示意圖見圖1.

圖1 一體式PNA反應器運行試驗裝置Fig.1 Schematic diagram of the lab-scale one-stage PNA reactor

1.1.2 接種污泥與試驗用水 反應器內接種污泥取自實驗室富集的厭氧氨氧化顆粒污泥,污泥顆粒呈深紅色,沉降性能良好.試驗用水為自配模擬廢水,以氨氮為唯一氮源,不加入有機碳源.試驗期間進水氨氮濃度保持恒定,模擬廢水的具體配方如表1、表2所示.考慮反應器的排水比,單次進水的氨氮濃度實際約為254mg/L.

表1 一體式PNA反應器的模擬廢水水質Table 1 Components of the synthetic wastewater for the one-stage PNA reactor

表2 儲備液配方Table 2 Components of the stock solution

1.1.3 運行方式與分析項目 反應器從 32℃啟動,經4次降溫,至22℃穩定運行.全程采用序批式運行方式,每個周期由6個階段組成:進水（8.5min）、厭氧攪拌（50min）、曝氣（220～285min不等）、厭氧攪拌（40min）、沉淀（10min）和出水（2min）.反應器運行溫度從32℃逐級降溫至22℃.曝氣階段運用間歇曝氣（連續曝氣 5min之后停止曝氣 7min,再開始曝氣,以此類推）,且始終保持體系內低DO值.試驗中通過轉子流量計控制曝氣流量約1.2L/min.

試驗中主要測定和分析出水水質.取反應器出水樣品后經 0.45μm 濾膜過濾后,測定 NH4+-N、NO2--N和NO3--N.測定方法參照國家環保總局編寫的《水和廢水監測分析方法》中的標準方法:NH4+-N的測定采用納氏試劑光度法,NO2--N的測定采用N（1-萘基）-乙二胺光度法,NO3--N的測定采用紫外分光光度法[21].

1.2 微生物活性分析

通過反應器穩定運行時周期內序批試驗來檢測體系內微生物的活性.序批試驗不同溫度下運行期間內進行,共計5次.具體方法為:在一個完整的周期內,每隔一定時間從反應器上部的取樣口取內部混合樣,經0.45μm濾膜過濾后,測定樣品中NH4+-N、NO2--N和NO3--N的濃度.

參考Lotti等[15]的方法,通過周期內序批試驗獲得周期內不同時間NH4+-N、NO2--N和NO3--N的濃度后,再據此計算出反應器內 AOB、NOB和AnAOB三種微生物的活性（Actual Volumetric Activity,AVA）.計算AOB和NOB活性時只考慮曝氣時的好氧階段,計算AnAOB活性時只考慮攪拌和間歇曝氣中的缺氧階段.AOB、NOB和AnAOB的活性分別以氨轉化速率（g NH4+-N/（L·d））、硝酸鹽產生速率（g NO3--N/（L·d））以及消耗氨氮和亞硝酸鹽氮的速率（g/（L·d））表示.

1.3 微生物群落結構分析

在試驗各階段的穩定運行期,通過反應器上部取樣口取內部混合樣,離心后棄去上清液,保留活性污泥樣品并于-80℃條件下凍存;每個溫度下均取 3個平行樣.試驗結束后,將所有樣品統一進行16S rDNA的V3-V4可變區的擴增,引物采用細菌通用引物338F-806R.DNA的提取、PCR擴增以及測序均在上海美吉生物醫藥科技有限公司（上海,中國）完成.對非重復序列在 97%相似性水平下進行可操作分類單元（Operational Taxonomic Units,OTUs）聚類,并將OTUs與Silva 16S細菌和古菌核糖體數據庫比對,實現分類注釋,得到 OTUs表格;數據的可視化在美吉生物云平臺（www.majorbio.com）進行.

2 結果與討論

2.1 反應器常溫運行效能

試驗全過程反應器共運行72d,依據運行溫度分為 5個階段,每天測定出水的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度,并根據前一天的出水水質及排水比計算當天實際進水后的氨氮濃度.試驗過程中進出水水質如圖2所示.

反應器運行的72d中,出水NO2--N和NO3--N濃度相對穩定,尤其出水 NO2--N濃度很低,除個別天外均保持在 10mg/L以下,有 47d達到了 5mg/L以下.這印證了一體式PNA反應器具有低亞硝酸鹽氮積累的優勢.但出水 NO3--N有隨溫度下降而逐漸上升的趨勢,可能因為后期試驗過程 NOB活性升高而AOB和AnAOB活性下降,故亞硝酸鹽更易被氧化為硝酸鹽.前人研究顯示,若 NOB完全被抑制,則NO3--N產生量與NH4+-N的消耗量比值（△NO3--N/△NH4+-N）理論上為0.11[15];而本試驗在不同溫度下的△NO3--N/△NH4+-N均大于該值,且比值隨溫度降低而增加,故可認為出水 NO3--N升高與NOB受到的抑制作用減弱有關.出水NH4+-N濃度在 0～30mg/L之間,其變化直接影響出水總無機氮的濃度.

反應器運行過程中,某典型周期水質變化情況見圖 3.在進水和隨后的攪拌初期（0～20min）,由于進水中僅含 NH4+-N,故其濃度顯著上升;NO3--N濃度由于稀釋作用而下降;NO2--N濃度略有上升,可能由于進水過程中并非完全厭氧環境,AOB有一定活性,抵消了進水的稀釋作用.此后的一段厭氧攪拌時間（20～48min）,NH4+-N 和 NO2--N濃度略有下降,NO3--N濃度上升,可能有少量厭氧氨氧化反應發生.間歇曝氣階段中（48～288min）,NH4+-N 濃度大幅減小,NO3--N濃度有所上升,NO2--N濃度上下波動,主要是由于曝氣時NH4+-N主要被氧化為NO2--N,少部分NO2--N又會被進一步氧化為NO3--N;不曝氣時發生厭氧氨氧化反應,NO2--N和剩余的 NH4+-N被消耗,并產生 NO3--N.進入厭氧攪拌階段后（288～338min）又會發生厭氧氨氧化反應,但剩余基質濃度有限.經過沉淀階段（338～348min）,顆粒污泥沉降至反應器底部,最后反應器出水.

圖3 一體式PNA反應器某典型周期內水質變化Fig.3 Nitrogen profile in a typical cycle of the one-stage PNA reactor

根據出水水質可計算總氮容積負荷（NLR）和總氮去除負荷（NRR）,見圖4.NLR和NRR隨周期總時長的調整和進出水水質的不同而有所改變,多數時間 NLR在 1.0～1.2g/（L·d）,NRR 在 0.7～0.9g/（L·d）,故反應器在整個試驗過程中運行脫氮性能較為穩定.NLR隨溫度變化存在波動,但范圍不大,說明溫度對反應器的負荷影響不甚明顯,波動主要是調整曝氣時間從而使運行周期時長變化所導致;30℃運行時NLR最大.NRR在32℃運行時最大,隨著溫度降低而持續減小,說明降溫對一體式PNA反應器脫氮效果有負面影響.本反應器在 22℃運行時 NRR平均達 0.72g/（L·d）,相較其他研究中同溫度運行的PNA反應器更高[16,22],說明本試驗中反應器運行工況良好.

根據進出水水質計算出總氮（TN）去除率,如圖4.一體式 PNA 工藝的總氮（TN）去除率理論值為89%.但本試驗 TN 去除率為 62%～88%（除第 42,43,56d由于特殊情況低于60%）;且隨溫度的降低TN去除率在波動中有下降的趨勢.從理論角度分析,PNA工藝利用厭氧氨氧化反應將水體中氮元素轉化為N2實現脫氮,而PNA體系內厭氧氨氧化的進行又依賴于好氧氨氧化,因此可推測 TN去除率下降與AnAOB或 AOB活性隨溫度下降相關.從出水數據上分析,本試驗TN去除率低于理論值主要因為出水NO3--N濃度依然較高,這又與 NOB的活性及其受到的抑制作用相關.由此可見,試驗全程中 TN 去除率隨溫度下降略有下降的趨勢,很可能與反應器內微生物的活性變化相關,需進一步驗證.

2.2 功能微生物活性分析

根據周期內序批試驗測得的氮素濃度變化的結果可計算出AOB、NOB和AnAOB三種功能微生物各溫度下的實際活性,見表3.

表3數據顯示,一體式反應器體系內AOB活性始終高于 AnAOB,故本反應器脫氮的限速步驟在于厭氧氨氧化反應.故反應器運行一個周期內總厭氧時長多于總好氧時長（間歇曝氣中除去不曝氣的時間段）,以這樣的時間比例運行可以達到穩定的脫氮效果.NOB的活性遠低于AOB和AnAOB,說明反應器運行中NOB受到了較好的抑制.28℃序批試驗NOB活性高于其他溫度,推測由于反應器中剩余 NH4+-N不足限制了AOB,曝氣最后階段NOB占優,NO3--N濃度顯著增加,故計算出的NOB實際活性高.

表3 一體式PNA反應器內AOB、NOB和AnAOB的微生物活性Table 3 Actual volumetric activity（AVA）of AOB,NOB and AnAOB

從表 3結果可知,隨著反應器運行溫度下降,AOB活性下降最為明顯,從 32℃的 3.82g NH4+-N/（L·d）減至 22℃的 2.73g NH4+-N/（L·d）.除 28℃以外,AOB活性持續下降而NOB活性在波動中反而上升,使得 AVANOB/AVAAOB隨溫度降低而升高,這表明在與AOB的競爭中NOB受到的相對抑制作用減弱,從而直接證實了根據出水水質變化做出的推測.此外,3種微生物中只有AOB活性持續下降,這意味著反應器運行效果隨溫度略有下降與AOB活性（即亞硝化速率）直接相關.因此,若運行溫度繼續下降,則需要進一步調整運行策略以保證對NOB的抑制,如更加精準監控曝氣流量與 DO、保持足夠剩余氨氮濃度等[9].試驗中AnAOB在25℃～32℃之間活性差異不大,降溫至 22℃后活性有了明顯下降,這與反應器運行實際情況相符:最初幾次降溫后水質沒有出現明顯波動,然而當降溫至 22℃時反應器出現失穩,經調控后才恢復穩定運行（圖3第56d）.AnAOB和厭氧氨氧化反應的最適溫度在 30℃～40℃不等[23];而本研究中 AnAOB的活性數據表明,反應器中的AnAOB已經完全適應了25℃左右的中溫系統,降溫至 22℃活性有下降,但通過控制運行條件并未對反應器脫氮效果造成顯著影響,因此一體式PNA反應器的常溫穩定運行得以實現.

2.3 微生物群落結構分析

2.3.1 群落組成與核心功能微生物識別 本試驗對5個顆粒污泥樣本進行16S rDNA擴增,共產生349566條有效序列,以最小樣本序列數抽平后5個樣本序列總數為273480.本試驗在NCBI數據庫的項目編號為 PRJNA658444,5個樣本測序原始數據的Sequence Read Archive（SRA）序列登陸號 為 SRR12489534（22℃）,SRR12489535（25℃）,SRR12489536（28 ℃）,SRR12489537（30 ℃）和SRR12489538（32℃）.

聚類分析結果表明,從所有樣本中共得出 600個OTUs代表序列,與數據庫比對后發現門水平上顆粒污泥中的優勢菌群為Chloroflexi、Proteobacteria、Planctomycetes和Bacteroidetes（圖5）.AOB所在的門 Proteobacteria在樣品中的相對豐度為 14.9%～23.9%,AnAOB所在的門 Planctomycetes在樣品中的相對豐度為7.5%～17.7%.在屬水平上,豐度最高的微生物為 Chloroflexi門 Anaerolineae綱的代號為SBR_1031某種未培養細菌,相對豐度為 19.1%～44.4%;AOB的優勢屬為 Nitrosomonas,相對豐度為2.8%～11.5%;發現兩個豐度較高的 AnAOB 屬,Candidatus Brocadia相對豐度為2.7%～15.1%,Candidatus Jettenia為2.2%～4.6%;共發現兩個屬的NOB,Nitrospira相對豐度為0.033%～0.068%,Nitrolancea為0.013%～0.062%,NOB豐度很低證明了本研究間歇曝氣和低DO的反應器運行策略的有效性.

圖5 一體式PNA反應器污泥中微生物群落結構Fig.5 Microbial community of the sludge in the one-stage PNA reactor

在PNA系統中,除自養微生物以外還經常有異養菌存在,通常屬于 Chloroflexi,Ignavibacteriae,Bacteroidetes和Proteobacteria門等[24-25].它們能以胞外多聚物和溶解性的微生物代謝產物等有機物為碳源,大多還具備反硝化功能.本研究的一體式 PNA反應器中發現了異養反硝化菌 Denitratisoma,相對豐度為 3.0%～6.5%.但小試實驗表明異養反硝化對于系統整體脫氮貢獻很小,推測原因在于系統內缺乏足量碳源.

2.3.1 群落結構隨溫度變化 圖 6顯示了反應器內豐度最高的 20個物種豐度隨溫度的變化情況.AOB的優勢屬為 Nitrosomonas,其相對豐度隨溫度下降逐漸上升（圖 6）,32℃時相對豐度僅為 2.8%,至22℃相對豐度達11.5%.因此,降溫未對AOB生長造成不利影響.AnAOB整體的相對豐度同樣隨溫度降低而上升（圖 6）,32℃相對豐度為 7.3%,22℃達17.3%,但在降溫過程中優勢屬轉變.Candidatus Brocadia在32℃相對豐度為2.7%,低于Candidatus Jettenia（4.6%）;溫度降低 Candidatus Brocadia豐度持續增加 Candidatus Jettenia豐度下降,到 22℃Candidatus Brocadia相對豐度為 15.1%,遠高于Candidatus Jettenia（2.2%）.推測 Candidatus Brocadia屬更能適應低溫條件,這與前人發現的結果一致[15,26-27].NOB的相對豐度在試驗全程均很低,且豐度隨降溫進一步下降,說明降溫不利于其生長.

圖6 一體式PNA反應器污泥中相對豐度最高的20個物種屬水平熱圖Fig.6 Heatmap of the 20most abundant genera in the one-stage PNA reactor

除以上功能微生物外,反應器污泥內的異養反硝化菌 Denitratisoma的相對豐度同樣隨溫度降低而升高,證明反應器內自養微生物分泌的有機物（如胞外多聚物）能夠使反應器內的異養菌存在并增殖;而Chloroflexi門代號為SBR1031的菌群盡管相對豐度一直最高,然而其豐度卻隨降溫而持續下降,說明若反應器繼續降溫運行,該菌可能會失去優勢.

微生物群落結構隨溫度變化的結果可進一步佐證溫度對微生物活性的影響.2.2節活性分析表明,溫度降低AOB活性持續下降,AnAOB降溫至22℃之后活性有明顯下降,而 NOB活性在波動中上升;但從群落結構角度看,降溫后AOB和AnAOB的相對豐度反而上升,NOB豐度卻下降.由于微生物活性通過其反應速率顯示,相對豐度在低溫時更高排除了活性（即計算出的脫氮反應速率）下降是因為微生物數量變少的可能,進一步證明了 AOB和 AnAOB菌體自身的活性在低溫下會受到抑制.低溫雖使NOB豐度下降,但整體活性沒有顯著變化.因此,降溫對AOB和AnAOB活性的抑制作用比NOB更加明顯.

3 結論

3.1 一體式PNA反應器可在常溫下穩定運行,出水水質良好.采用顆粒污泥序批式反應器,單次進水濃度約254mgNH4+-N/L,從中溫32℃啟動,逐級降溫至22℃,試驗全程出水 NO2--N 濃度均很低（基本＜10mg/L）,但 NO3--N隨降溫略有升高;出水NH4+-N在0～30mg/L之間波動,其變化直接影響出水總無機氮濃度.試驗期間反應器運行工況整體穩定.總氮去除率為62%～88%.

3.2 溫度對一體式PNA反應器污泥內微生物活性有明顯影響.所有溫度下,AOB活性均高于AnAOB,反應器脫氮限速步驟在于厭氧氨氧化反應;且 NOB得到較好抑制.降溫時 AOB活性持續下降,從 32℃的 3.82gNNH4+-N/（L·d）降至 22℃的 2.73g NH4+-N/（L·d）;這使 NOB 受到的相對抑制作用減弱.AnAOB降溫至 22℃后活性才有明顯下降,從 1.66g/（L·d）降至 1.45g/（L·d）.盡管降溫使AOB和 AnAOB活性降低,但可通過調整運行條件來減弱其對反應器脫氮效果的影響.

3.3 降溫會使一體式PNA反應器污泥內微生物群落結構發生變化.AOB和 AnAOB的相對豐度均隨降溫明顯上升.降溫也使 AnAOB的優勢屬從Candidatus Jettenia轉變為 Candidatus Brocadia.溫度降低也使反應器內異養反硝化菌Denitratisoma的相對豐度增加,但Chloroflexi門的SBR_1031菌豐度隨降溫持續下降.