黃海北部真核微藻粒級結構及環境關聯

宋 倫,畢相東,付 杰,宋廣軍,吳金浩,劉 印,劉蘇萱（.遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧省海洋生物資源與生態學重點實驗室,遼寧 大連 60；.天津農學院水產學院,天津市水產生態及養殖重點實驗室,天津 0084；.大連海洋大學,遼寧 大連 60）

黃海北部是海水貝類主要增養殖區,但近十多年扇貝、牡蠣、雜色蛤等濾食性貝類普遍出現滯長、肉質偏瘦、死亡率升高等現象,限制了海洋漁業可持續健康發展.作為濾食性貝類的餌料基礎—海洋微藻,在生理功能、沉降速率和被攝食壓力等方面存有差異,致使微藻粒級對生態系統的食物網結構影響較大[1].由于濾食性貝類對餌料微藻具有選擇性策略[2],因此微藻粒級結構會影響其營養儲備和健康生長,小粒級微藻對質量選擇型的貝類影響更大[3].然而微型（2～20μm）和微微型（0.22～2μm）藻類個體微小、形態學鑒定困難,粒級結構研究較為遲緩.

褐潮的暴發引起了各界對小粒徑微藻研究的高度關注[4-5],高通量測序分子鑒定技術的發展極大地推動了小粒徑微藻多樣性的高效檢測,進而加速了其對生態系統的影響研究[6-7].然而,有關微藻粒級結構的測算方法亟待優化.

目前微藻粒級測算技術主要有葉綠素 a分級法、電子粒度分析儀法、流式細胞術法、顯微測量粒徑分析法、分子鑒定法等,其中前三種可對微藻生物量進行粗略區分,無法獲取各組分種類信息,顯微測量粒徑分析法無法觀測微微型和部分微型藻類,然而該組分在整個微藻群落中占比較大.研究發現,葉綠素a分級法、電子粒度分析儀法都會低估中、小微藻的生物量,而高估＞20μm 小型微藻的貢獻[8].目前常用的葉綠素a分級法由于大孔徑濾膜截留率較高嚴重低估了小粒徑微藻的貢獻,誤差最高超過80%[9-10].分子鑒定雖然還存在一些問題,但比傳統形態學鑒定方法更為精準、客觀、高效,可大大提高微微型藻類的檢出率,隨著高通量測序技術的發展極大地推動了微型藻類的高效檢測研究,為微藻粒級研究提供了新思路.

由于不同真核生物中rDNA的拷貝數差異較大,因此rDNA擴增子測序所獲的序列數并不能表征環境樣本中真核微藻的豐度[11].但相關研究發現,rDNA序列多態性與細胞中 rDNA的拷貝數成正比[12],而真核微藻細胞體積（生物量）與rDNA的拷貝數成正比[13-15],因此,真核微藻分子鑒定獲取的序列數可表征其生物量大小,用于微藻全粒級結構研究可行.宋倫[16]采用高通量測序-分子鑒定分級技術研究發現,2018年春季大連長海縣大長山島鄰近海域小粒徑微藻（0.22～3μm）粒級組成主要受總氮影響較大,夏季受總氮、總磷影響顯著,秋季受溶解硅影響顯著,大粒徑微藻（＞20μm）粒級組成在夏季主要受溶解無機磷影響較大,中粒徑微藻（3～20μm）粒級組成受上述環境因子影響不顯著.

然而整個黃海北部海域微藻粒級結構在時空上如何演變,哪些環境因子對各粒級微藻影響顯著,需要進一步研究和分析.基于此,本文采用高通量測序-分子鑒定分級技術對黃海北部微藻粒級結構進行研究,以期解析濾食性貝類的供餌力基礎及環境關聯.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及制備

2019年在黃海北部海域垂岸布設12個站位（圖1）,分別于 2019 年 5 月（春）、8 月（夏）、10 月（秋）采集真核微藻分子鑒定樣品.

圖1 采樣站位示意Fig.1 Sampling sites

每個站位采集表層海水1L,現場用0.22μm微孔濾膜收集全部微藻,然后將濾膜轉移至 1.5mL無菌離心管中,置于-20℃冷凍保存、運輸.同期進行海水的水深（Dep）、pH、鹽度（Sal）、溶解氧（DO）、懸浮物（SS）、葉綠素 a（Chla）、化學需氧量（COD）、石油類（Oil）、無機氮（DIN）[銨鹽（NH4+）、硝酸鹽（NO3-）、亞硝酸鹽（NO2-）之和]、無機磷（DIP）、總氮（TN）、總磷（TP）、硅酸鹽（SiO32-）、重金屬汞（Hg）、鉛（Pb）、銅（Cu）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、砷（As）等指標的監測.調查、檢測、質量控制方法均參照《海洋調查規范》（GB/T 12763-2007）[17]和《海洋監測規范》（GB17378-2007）[18]執行.

1.2 微藻基因組DNA提取

采用 CTAB法提取真核微藻宏基因組,將濾膜剪碎置于1.5mL離心管中,加入500μL CTAB裂解液（2% CTAB;100mmol/L Tris-Cl,pH為8.0;1.4mmol/L NaCl;10mmol/L EDTA）和 1μL β-巰基乙醇,5～10μL蛋白酶K,55℃裂解1～1.5h;短暫離心,取出液體置于新離心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清液,加入兩倍體積預冷的無水乙醇,沉淀 2～3h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到浮游生物基因組 DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度,合格后置于-20℃冰箱保存備用.

1.3 18S rDNA V4可變區的PCR擴增

該研究應用的引物為自行開發的真核微藻18S rDNA V4區基因擴增引物——V4（F/R）.上游引物為V4-F序列 5'-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3',下游引物為V4-R序列5'-GATCCCCHWACTTTCG TTCTTGA-3'[19].將引物連接適當的接頭送往上海生工生物公司進行合成.PCR反應體系為 50 μL,包括 PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物（10μmol/L）各 2μL、模板 DNA 2μL、Taq DNA 聚合酶2.5U,加適量滅菌水.擴增反應均在PE 9700型PCR儀（美國PE公司）上完成,反應條件:94℃預變性3min;94℃變性 30s,58℃退火 45s,72℃延伸 45s,共33個循環;72℃延伸5min.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,將檢測合格的產物交由諾和致源生物信息科技有限公司,使用 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量（Thermo Scientific）和文庫檢測,合格后,使用Hiseq2500PE250模式進行上機測序.

1.5 測序數據質量控制

通過IlluminaHiSeq 2500測序平臺進行PE250模式測序,所得原始數據使用 FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質量控制流程,將拼接后的序列經過截取、過濾得到有效數據.原始序列需經過拼接和質量過濾,為保障數據準確可靠,高質量數據需占到90%以上,為進一步分析物種組成多樣性信息,使用 Uparse軟件對所有樣品的有效序列進行聚類分析,以 97%的一致性將序列聚類成為 OTUs種水平[20],剔除浮游動物OTUs數據后得到微藻注釋信息.

1.6 數據分析

利用 Uparse（http://drive5.com/uparse/）對有效數據進行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類,采用RDP Classifier方法與SILVA數據庫（https://www.arb-silva.de/,Version 108）對OTUs代表序列進行物種注釋[21].根據相關研究,不同粒徑的真核微藻序列數比例更接近于生物量比例[13-16],將各個站位所獲得的優勢度超過 0.1%的種類均作為整體優勢種參與粒級生物量比例統計,參考相關文獻將篩查出的優勢種粒徑進行篩檢分級[13-15,22-25],根據各粒徑微藻序列占比統計其粒級結構,同時利用序列數占比和總葉綠素a含量可測算某種粒級微藻的葉綠素a濃度,相關公式:

式中:DBi為某粒級微藻的葉綠素 a濃度,μg/L;NBi為總葉綠素a濃度,μg/L;DC為某粒級微藻的序列數;NC為所有微藻的序列數.

物種生物量優勢度（Y）表示微藻群落中某一物種質量所占的優勢程度:

式中:nx為第x種微藻種類的OTUs數,N為OTUs總數,fx為第x種微藻種類在各樣品中出現的頻率.

本文的小、中、大粒徑微藻分別代指微微型藻類（0.22～3μm）、微型藻類（3～20μm）及小型藻類（＞20μm）.

對上述公式計算、數據分析、分布餅圖繪制均通過WPS Office、SPSS 19.0、ARGIS10.2軟件完成.

2 結果

2.1 真核微藻各粒級優勢種演替規律

黃海北部各粒級微藻第一優勢種及優勢度見表1,主要真核微藻粒級名錄見表2（各站位所獲得的序列數優勢度超過0.1%的種類）.參與統計的真核微藻總生物量占總檢出真核微藻生物量的 97%以上,可代表整個真核微藻群落用于粒級結構分析.

表1 各粒級微藻第一優勢種及優勢度Table 1 The first dominant species and dominant degree of microalgae in each grain size

表2 主要微藻粒級名錄Table 2 The granulation of dominant species of microalgae

其中,小粒級微藻春季細小微胞藻、融合微胞藻、曼吉尼刺囊甲藻在小粒級微藻群落中生物量優勢度較高,分別為 0.183、0.159、0.111;夏季細小微胞藻、金牛微球藻、青綠藻生物量優勢度較高,分別為0.290、0.229、0.121;秋季金牛微球藻、曼吉尼刺囊甲藻、細小微胞藻生物量優勢度較高,分別為0.488、0.156、0.120.綜合來看細小微胞藻和金牛微球藻在小粒級微藻群落中占有絕對優勢,春夏秋季演替規律由細小微胞藻占優勢轉為金牛微球藻控制生態位.由于小粒級微藻粒徑較小,細胞中 rDNA的拷貝數較少,推測其數量優勢度在整個微藻群落中占有絕對優勢.

中粒級微藻春季劇毒卡爾藻和三葉原甲藻在中粒級微藻群落中生物量占有絕對優勢,優勢度分別為0.429、0.141;夏季劇毒卡爾藻、蟲黃甲藻、三葉原甲藻生物量優勢度較高,分別為0.450、0.132、0.095;秋季劇毒卡爾藻和三葉原甲藻生物量優勢度較高,分別為0.619、0.106.綜合來看各季節劇毒卡爾藻在中粒級微藻群落中一直占有絕對優勢.

大粒級微藻春季柔弱幾內亞藻、北極多甲藻、矮小短棘藻、中肋海鏈藻、微型裸甲藻在大粒級微藻群落中生物量優勢度較高,分別為0.330、0.181、0.120、0.119、0.105;夏季平野亞歷山大藻和紅色赤潮藻生物量優勢度較高,分別為0.574、0.103;秋季多紋膝溝藻生物量占有絕對優勢,優勢度為0.882.大粒級微藻優勢種在各季節演替較大,分別由不同種類占據主要生態位.

綜合整個真核微藻種群優勢分析,春季由中粒徑的劇毒卡爾藻占有絕對優勢,占比 21.3%,其他微藻占比均小于 7%;夏季由大粒徑的平野亞歷山大藻占有絕對優勢,占比23.6%,其他微藻占比均小于11%;秋季由大粒徑的多紋膝溝藻占有絕對優勢,占比高達56.6%,其他微藻占比均小于 11%.由此可見,雖然整個微藻群落由大粒級微藻控制生態位,但都是有毒的甲藻,對黃海北部增養殖的貝類貝毒累積風險較高.

2.2 真核微藻粒級結構特征

真核微藻粒級結構分析結果顯示,春季小粒級微藻組成分布在 27%～54%,平均（39±6）%,中粒級微藻組成分布在25%～67%,平均51±8%,大粒級微藻組成分布在 6%～22%,平均（11±2）%（圖 2a）.

夏季小粒級微藻組成分布在 8%～72%,平均（40±18）%,中粒級微藻組成分布在 2%～64%,平均（24±14）%,大粒級微藻組成分布在 8%～84%,平均（36±26）%,各站位分布差異比較大（圖2b）.

秋季小粒級微藻組成分布在 1%～89%,平均（26±19）%,中粒級微藻組成分布在 1%～34%,平均（13±7）%,大粒級微藻組成分布在 9%～99%,平均（62±18）%,各站位分布差異比較大（圖2c）.

圖2 春、夏、秋季真核微藻粒級組分Fig.2 Size fractions of eukaryotic microalgae in spring,summer and autumn

整體而言,黃海北部春季真核微藻以中、小粒級為主,各站位粒級結構相對比較均衡,整體生物量較高（圖3a）,小、中、大粒級微藻比例為39:51:11;夏季以小、大粒級為主,各站位粒級結構波動較大,整體生物量較低,小粒級微藻主要分布在近岸海域,大粒級微藻主要分布在離岸海域（圖 3b）,小、中、大粒級微藻比例為 40:24:36;秋季除鴨綠江口附近海域以小粒級微藻為主外,其他區域主要以大粒級為主,各站位粒級結構相對比較均衡,整體生物量有所回升（圖 3c）,小、中、大粒級微藻比例為26:13:62.

圖3 春、夏、秋季真核微藻粒級生物量分布Fig.3 Distribution of size biomass of eukaryotic microalgae in spring、summer and autumn

2.3 真核微藻粒級結構與環境因素關聯

春、夏、秋季黃海北部真核微藻粒級結構與環境因子的相關系數見表 3.其中,春季與小粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有懸浮物和活性硅酸鹽,顯著負相關的有水深、重金屬汞、鹽度、砷,其中與水深、重金屬汞相關極顯著;與中粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有懸浮物、活性硅酸鹽、化學需氧量、硝酸鹽、無機氮,其中與懸浮物、活性硅酸鹽相關極顯著,顯著負相關的有水深、鹽度、重金屬汞、鎘,其中與前三項因子相關極顯著;與大粒級微藻生物量顯著負相關的環境因素有水深、重金屬汞,達到極顯著水平,無顯著正相關環境因子.

表3 微藻粒級組成與環境因子相關性Table 3 Correlation between microalgae particle size structure and environmental factors

夏季與小粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有石油類、亞硝酸鹽、無機氮、活性硅酸鹽、總氮、總磷、活性磷酸鹽、重金屬銅,其中與石油類、亞硝酸鹽、無機氮、活性硅酸鹽、總氮相關極顯著,顯著負相關的有水深、pH值、鹽度、重金屬鉛,其中與水深、pH值、鹽度相關極顯著;與中粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有溶解氧、石油類、亞硝酸鹽、無機氮、總氮、活性硅酸鹽和重金屬鋅、銅,其中與溶解氧、石油類、亞硝酸鹽、無機氮、總氮相關極顯著,顯著負相關的有水深、pH值、鹽度和重金屬鉛,其中與前三項因子相關極顯著;與大粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有亞硝酸鹽、無機氮、總氮、石油類,其中與亞硝酸鹽相關極顯著,無顯著負相關環境因子.

秋季與小粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有重金屬汞、砷,其中與重金屬汞相關極顯著,顯著負相關的有水深、pH值、鹽度;與中粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有溶解氧、懸浮物、亞硝酸鹽、氨氮、無機氮、總氮、活性硅酸鹽、化學需氧量和重金屬鋅、銅,其中除了化學需氧量和重金屬銅,與其他因子相關極顯著,與砷極顯著負相關;與大粒級微藻生物量顯著正相關的環境因素有懸浮物、化學需氧量、石油類、亞硝酸鹽、活性硅酸鹽、無機氮、總氮、溶解氧和重金屬銅,其中與懸浮物、化學需氧量、石油類、亞硝酸鹽、活性硅酸鹽相關極顯著,無顯著負相關環境因子.

總體來看,水深、pH值、鹽度、無機氮、總氮、活性硅酸鹽及部分重金屬與真核微藻粒級結構演變顯著相關,直接影響不同粒級微藻的時空變動.

3 討論

3.1 真核微藻粒級結構特征分析

本海域相關研究主要集中在長海縣海域,2018年大長山島臨近海域小粒徑真核微藻生物量組成春季為86%,夏季為52%,秋季為20%[16].本研究2019年長海縣海域小粒徑真核微藻生物量組成春季為38%,夏季為 72%,秋季為 39%.出現的差異主要是春季優勢種發生演替,2018年春季優勢種為抑食金球藻,生物量占41%,2019年春季優勢種為細小微胞藻,生物量占18%,而抑食金球藻生物量僅占9%.夏、秋季優勢種 2個年度均為細小微胞藻和金牛微球藻.吳文廣利用葉綠素a分級法發現2015年該海域秋季小粒徑（＜2μm）微藻生物量占 2%,中粒徑（2～20μm）占 65%,大粒徑（＞20μm）占 33%[3].由于葉綠素 a 分級法測算微藻粒級結構誤差較大,可能會嚴重低估小粒徑微藻的生物量組成[9,16],但也不排除調查時優勢種演替及環境因子不同而造成的差異.

當然,利用測序所得的序列數比例表征生物量占比也存在偏差,但該方法與葉綠素 a分級法相比更接近實際,如在褐潮暴發微微型藻類占優勢的區域葉綠素a分級法卻顯示微型藻類組成較高[24-26].

3.2 敏感微藻分布與貝類養殖風險分析

濾食性貝類主要攝食餌料微藻,而微藻營養（粒徑大小）及毒性直接影響貝類生長與品質安全.本研究在黃海北部海域共發現 16種潛在褐潮微藻（＜3 μm 小粒徑微藻）,其中金牛微球藻和抑食金球藻曾在渤海海域引發褐潮[19],并且這 2種褐潮微藻均會影響貝類攝食[25-26],濾食性貝類增養殖風險較高[27].長海縣是我國蝦夷扇貝主產區,近些年出現的大規模死亡現象可能與該海域餌料微藻粒級結構發生改變有關[16],關于微藻粒級小型化機制有待于進一步研究.另外,本研究海域雖然大粒徑真核微藻在個別站位優勢度較高,尤其在秋季占絕對優勢,但主要優勢種均為有毒甲藻,如亞歷山大藻含有麻痹性貝毒,多紋膝溝藻和紅色赤潮藻含有溶血毒素,具刺膝溝藻含有蝦夷扇貝毒素,以及中粒徑優勢種劇毒卡爾藻,嚴重影響著增養殖貝類的食用安全[28].

3.3 微藻粒級結構的環境影響因素

相關研究發現,大長山島海域與微藻粒級結構演替相關的環境因子主要為總氮、總磷、活性硅酸鹽等[16],本研究也發現這幾種因子與微藻粒級結構演替顯著相關.還有研究發現無機氮是影響秋季獐子島海域微藻生長和群落結構的主要因子,而硅酸鹽可能成為影響大粒徑微藻（＞20μm）生長的重要因子[3],與本研究結論也基本一致.雖然各研究時期粒級結構不盡相同,但與環境因子關聯結果總體一致.

由于調查海域站位間距較大,水深、pH值、鹽度等有所差異,對中、小粒級微藻分布影響顯著,但都是負向影響.已有研究表明,一般自養微藻都喜好無機營養鹽[28-29],氮、磷、硅都是微藻生長必須元素[30],本研究海域無機氮、總氮、活性硅酸鹽對微藻粒級結構也都是正向影響,部分重金屬作為微量元素,適量范圍內可刺激微藻生長,但超量則起到抑制作用,比如本研究中重金屬汞春季抑制微藻生長,到了秋季則促進小粒級微藻生長,適量銅、鋅可促進微藻生長,過量鉛、鎘、砷可抑制微藻生長,適量石油類也可促進微藻快速生長[31-36].

本研究與微藻粒級結構演替極顯著相關的環境因子對各站位各季節微藻群落結構影響較大,各環境因子之間也相互耦合關聯,水深較淺區域,營養鹽和重金屬含量相對較高,反之亦然.本研究海域水深較淺海域,小粒級微藻含量較高,除受環境因子的上行效應影響之外,貝類及浮游動物大量攝食的下行效應也會影響微藻的粒級結構[2].黃海北部海域主要增養殖對象為雜色蛤、扇貝、牡蠣等濾食性貝類,對天然餌料微藻需求量較大.雖然鴨綠江、大洋河等每年攜帶陸源氮磷等營養鹽入海,但隨著入海河流污染整治,氮磷消減力度加大,海域無機營養鹽已呈下降趨勢,對微藻生物量及粒級結構影響較大.

4 結論

4.1 黃海北部真核微藻春季以中（51%）、小粒級（39%）為主,夏季以小（40%）、大粒級（36%）為主,秋季以大粒級（62%）為主.

4.2 小粒徑微藻中金牛微球藻和抑食金球藻曾在渤海引發褐潮,潛在威脅貝類養殖業.另外有毒甲藻在該海域中占有絕對優勢,中粒徑的劇毒卡爾藻在春夏秋季優勢明顯,優勢度在 0.4以上,貝毒累積風險較高.

4.3 水深、pH值、鹽度、無機氮、總氮、活性硅酸鹽及部分重金屬等環境因素對黃海北部真核微藻粒級結構影響較大.