溶解氧對Anammox濾池內功能菌群及活性的影響

武文君,劉秀紅,崔 斌,劉潤雨,楊 慶（北京工業大學,北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室,北京 100124）

厭氧氨氧化工藝是一種節省運行成本的高效可持續污水處理工藝,與傳統反硝化技術相比,既可節省碳源[1]又可節省曝氣量[2].厭氧氨氧化工藝已經被廣泛應用于高氨氮污水處理,城市污水厭氧氨氧化工藝在部分水溫較高地區已實現工程應用,但進一步推廣應用仍存在諸多困難.

目前有關城市污水厭氧氨氧化技術的研究主要集于工藝運行與條件優化[3]以及系統中脫氮功能菌的微生物學和分子生物學相關機理[4].溶解氧是常溫低基質厭氧氨氧化工藝非常重要的抑制性因素[5-6],低 DO（2%空氣飽和度）條件下,DO 對厭氧氨氧化過程的抑制作用是可逆的;但當空氣飽和度大于 18%時,會發生不可逆抑制作用[7].因此在僅具有厭氧氨氧化功能的系統中需嚴格控制溶解氧.雖然很多研究[7]發現厭氧氨氧化反應器是一個混合微生物系統,優勢菌為浮霉菌門（Planctomycetes）,亞優勢菌有變形菌門（Proteobacteria）,綠彎菌門（Chloroflexi）和綠菌門（Chlorobi）,但研究中更為關注系統中的厭氧氨氧化種屬和數量變化,對其他脫氮功能菌群及其活性的研究較少.

單級自養脫氮系統是厭氧氨氧化工藝應用于城市污水處理的重要工藝形式之一,長期以來廣大學者更加關注系統中多種脫氮功能菌群的相互作用關系[8],以及溶解氧對該工藝中功能菌數量[9]的影響.DO為2mg/L時,系統運行效能最佳,Anammox數量最多,AOB、NOB及 Anammox構成了協同代謝的穩態系統.但當 DO濃度從 1.7mg/L降低到1.0mg/L,AOB豐度下降了30倍,NOB豐度明顯增加,且AOB與NOB活性之比從12.8降到1.6.

在僅具有厭氧氨氧化功能的體系中,Anammox與其他脫氮微生物共存,只是人們在研究的過程中,由于更關注厭氧氨氧化作用,而忽略了其它功能菌.同時,嚴格控制無氧環境在實際應用中難以實現,這將限制工藝的應用與發展.因此,在僅具有厭氧氨氧化功能的體系中,更應研究菌群結構與關鍵功能菌群數量的變化等問題;同時應模擬實際水質環境,研究厭氧氨氧化關鍵抑制因素,如 DO[5],有機物[10]和重金屬[11]等,對系統脫氮微生物菌群、活性和動力學參數變化等的影響.但目前沒有針對僅具有厭氧氨氧化功能的系統內,關鍵氮素轉化功能微生物的動力學常數以及DO對其活性影響等方面的研究.

本文以穩定運行長達4a的Anammox濾池為研究對象,在分析測試菌群結構的基礎上,測定與分析關鍵脫氮功能菌AnAOB、DNB、AOB、NOB的動力學常數,探究DO對AnAOB、AOB和NOB活性的影響,以期為主流厭氧氨氧化工藝中菌群調控與工藝優化提供依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗裝置 主反應器為上流式生物濾池,濾料為火山巖,濾池自下而上分別為 20cm 承托層,60cm濾料層和20cm清水區,有效容積為9.3L.濾柱每隔20cm設一個取樣口和一個濾料口.濾池運行參數:水力停留時間（HRT）為2h,進水流量為77.93mL/min.

小試反應器由有機玻璃制成,反應器核心部分為圓柱形裝置,中部安裝有網狀濾斗,用于裝濾料,圓柱形反應器裝有試驗所需的模擬廢水,頂部用橡膠塞密封,并開有3個直徑不同的小孔,分別為 DO和pH值探頭孔以及曝氣孔,圓柱形側部開有2個小孔,分別為取樣和曝氣孔.

1.1.2 試驗用水 主反應器進水為合成廢水,進水NH4+-N和NO2--N濃度分別為40和52mg/L.4組間歇試驗分別測定厭氧氨氧化活性、反硝化活性及不同 DO 濃度下,氨氮降解速率和亞硝化降解速率.除反硝化活性試驗的基質是厭氧濾池出水,其余 3組試驗均采用合成廢水.氮源濃度分別為,試驗（1）NH4+-N:20mg/L,NO2--N:25mg/L; 試驗（2）NO3--N:10mg/L,COD:（100±6）mg/L;試驗（3）NH4+-N:20mg/L;試驗（4）NO2--N:35mg/L.間歇試驗調節pH值均為7.5～7.8,溫度為 25℃.微量元素Ⅰ:EDTA 5000mg/L,FeSO45000mg/L;微量元素Ⅱ:EDTA 15000mg/L,ZnSO4·7H2O 430mg/L,CoCl2·6H2O 240mg/L,MnCl2·4H2O 990mg/L,CuSO4·5H2O 50mg/L,NiCl2·6H2O 190mg/L,H3BO414mg/L.

1.1.3 污泥來源 由于濾池采用上流式運行方式,下部生物量相對豐富,在厭氧氨氧化濾池穩定運行的第255d取濾池下部40cm處的濾料,濾料上附著生物膜,測得該位置水質條件為 NH4+-N:（30±2）mg/L;NO2--N:（37±2）mg/L;DO 濃度:0.4～0.6mg/L.

1.2 試驗方法

1.2.1 水質分析方法 COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和MLVSS按照標準方法測定[12].DO和pH值采用在線檢測儀測定（德國,WTW 3630）.

1.2.2 微生物群落結構分析方法 采用DNA提取與實時熒光定量PCR分析方法分析功能菌群結構.濾料上的生物膜通過振蕩與濾料剝離,污泥或剝落的生物膜采用 DNA快速提取試劑盒（MP Biomedicals,Solon,OH,USA）進行DNA提取.實時熒光定量PCR反應擴增引物及條件詳見文獻[13].

1.2.3 間歇試驗測定功能菌活性 每組試驗反應溶液體積為 500mL,濾料體積為 50mL.試驗（1）和（2）設置DO濃度＜0.1mg/L,試驗（3）和（4）DO濃度設置5個梯度,分別為 0.2,0.4,0.6,0.8,1.5mg/L.以厭氧氨氧化活性試驗為例,批次試驗在體積為1L的圓柱形裝置中進行,使用磁力攪拌器攪拌,流量計控制流量,用氮氣瓶中的氣體進行曝氣,待DO濃度降至0.1mg/L以下,放入已用蒸餾水潤洗 3次后的濾料,隨后加入反應基質,反應過程保持厭氧狀態.其余 3組試驗根據氮源和 DO 條件作出相應改變,其它步驟同上.以上 4組試驗每隔一定時間取水樣,分別測定剩余NH4+-N、NO2--N、NO3--N、sCOD濃度,根據基質降解曲線計算活性大小.以上每組測試設置 3個平行試驗.

1.3 計算方法

AnAOB、AOB分別降解的NH4+-N濃度的計算如公式（1）～（3）所示.

式中:ΔTIN為去除總無機氮的濃度; NH4+-Nt0,NO2--Nt0和 NO3--Nt0分別為反應初始時 NH4+-N,NO2--N和NO3--N的濃度; NH4+-Nt,NO2--Nt,NO3--Nt是反應結束時剩余的 NH4+-N,NO2--N和NO3--N的濃度; NH4+-NAnAOB、NH4+-NAOB分別為AnAOB、AOB降解的NH4+-N濃度.

2 結果與討論

2.1 Anammox濾池脫氮功能菌

本文中,Anammox濾池已經在常溫下運行長達4a,反應器經過長期運行已經達到穩定狀態.圖 1給出了濾池進出水氮素濃度變化情況,當反應進行到182d時,出水NH4+-N濃度基本為零,平均TN去除率達 98%以上,ΔNO3--N/ΔNH4+-N 以及 ΔNO2--N/ΔNH4+-N 與厭氧氨氧化反應的理論值相近,分別為0.26和1.32.

圖1 Anammox濾池長期穩定運行情況Fig.1 Long-term stable operation performance of An-filter

取濾池下部樣品進行氮素轉化功能菌的豐度分析.從圖2可以看出,Anammox濾池是一個多種脫氮菌群共存的體系,包括 AnAOB、AOB、AOA、NOB、DNB等.AnAOB的豐度最高為2.38×109拷貝數/mg干污泥,同時 Nitrospira（亞硝酸鹽氧化細菌）和 nirK（亞硝酸鹽還原酶基因）表現出了較高的基因豐度,定量結果僅次于AnAOB.周薛楊[14]在EGSB反應器中接種中試一體化顆粒污泥,成功啟動厭氧氨氧化反應器,在系統穩定運行階段,利用 qPCR 手段對以上幾種脫氮功能菌進行定量檢測,結果表明,其中豐度最高的為 AnAOB,其次為 AOB,均高于本文所得豐度值,可能是由于反應器的種泥、厭氧氨氧化污泥形態以及運行條件不同造成.

圖2 厭氧氨氧化濾池下部菌群豐度Fig.2 The abundance of bacteria in the bottom An-filter

2.2 Anammox濾池AnAOB、DNB和NOB活性

2.2.1 AnAOB活性 圖3給出了厭氧氨氧化活性測定過程中氮濃度、DO和pH值變化過程,生物膜系統表現出了較高的厭氧氨氧化活性.反應共進行了 320min,該過程中氮素底物（NH4+-N和 NO2--N）濃度逐漸降低,約下降了26mg/L;同時pH值逐漸升高.將氮素底物濃度與時間線性擬合,R2=0.975,厭氧氨氧化活性（SAA）為 5.3mgN/（gVSS·h）.

圖3 SAA測定過程中各參數變化情況Fig.3 Changes of various parameters during during the test of anammox activity

表1總結了厭氧氨氧化相關工藝中氨氧化活性（SAOA）、亞硝酸鹽氧化活性（SNOA）和 SAA.Li等[15]的研究結果顯示,在絮狀和顆粒污泥混合的系統中,顆粒污泥的活性大于絮狀污泥,且與本文中生物膜的活性相近.本文結果與 Cui等[16]的研究結果相比,SAA略小,可能是由于Cui的試驗中接種了少量硝化污泥,AOB具有較高的氨氧化活性,為AnAOB提供了基質亞硝酸鹽,在一定程度上提高了厭氧氨氧化活性.Liu等[17]利用具有功能填料的生物膜反應器CSTR（連續攪拌反應器）進行活性試驗,測得生物膜中的厭氧氨氧化活性略小于本文中的值,可能與主反應器接種的污泥類型不同有關,Liu的試驗接種的是短程硝化污泥,后通過控制低 DO實現短程硝化厭氧氨氧化工藝,而本試驗直接接種的是污水處理廠反沖洗出來的成熟厭氧氨氧化生物膜,因此導致了二者之間的差異.本文同時發現雖然系統主要功能為厭氧氨氧化,但是仍然有一定的氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性.

表1 不同工藝中關鍵功能菌群活性Table 1 Activities of key functional bacteria in different processes

2.2.2 DNB活性 qPCR測試發現Anammox濾池中存在大量DNB（圖2）.Kindaichi等[18]曾提出,在沒有外加有機碳源,進水為合成廢水的厭氧氨氧化反應器中經常有DNB的存在,這些微生物可以吸收厭氧氨氧化菌細胞裂解衰敗后的微生物產物.本試驗中進水為合成廢水,無外加碳源,根據長期氮素去除情況可知,厭氧氨氧化為主要污染物去除途徑,因此推測 DNB可能長期以微生物死亡裂解的產物為基質,活性可能受到抑制.圖 4給出了反硝化活性試驗中NO2--N、NO3--N、COD及pH值、DO變化情況,以實驗室穩定運行的厭氧濾池[19]出水作為反應基質進行反硝化活性測定.0～15min時,COD快速降解和 pH值迅速增加表明,反應初始可利用的 COD較多,反硝化速率較快.隨著反應時間延長,可利用的COD大幅降低,COD/NO3--N較低,系統出現了少量亞硝酸鹽累積.反應進行到 120min時,COD略微增加,可能是缺氧環境下水中產生的溶解性微生物產物（SMP）導致的.普遍認為[20],在微生物降解污染物的過程中會產生大量的SMP.Urbain等[21]認為SMP分為兩種,分別為基質利用相關型溶解性微生物產物（UAP）和微生物內源呼吸相關型溶解性微生物產物（BAP）.根據陳宏宇[22]提到的 SMP形成過程,微生物首先利用原水中的基質作為碳源和能源進行生長,在此過程中會釋放少量 UAP.此外,UAP也可生物降解,當原水中可利用碳源被完全消耗后,微生物還可利用 UAP作為碳源及能源物質繼續維持其生長,在此過程中也產生 SMP.當所有可利用的基質被消耗后,微生物隨即進入內源呼吸期,產生BAP.此外,微生物在與環境相互作用過程中也會釋放SMP.

圖4 反硝化活性試驗中各參數變化情況Fig.4 Changes of various parameters in denitrification activity test

1mg/L NO3--N還原為N2理論上需要3.71mg/L COD,反應結束時NO3--N減少了大約3mg/L,理論上需要 COD 11.13mg/L,與實際值（約 15mg/L）接近.以NO3--N最大還原速率表示反硝化活性（SND）,SND為 0.93mgN/（gVSS·h）.上述結果表明厭氧氨氧化濾池系統內不但有DNB存在,而且具有一定活性.當進水中存在可利用COD時,即可發生反硝化作用.

2.2.3 NOB活性 圖5給出了反應底物僅有NO2--N時,隨著時間變化,不同DO濃度下NO2--N降解的情況.反應共進行了145min,試驗結果表明,各DO水平下NO2--N降解的量極少,厭氧氨氧化系統基本檢測不到NOB的活性.Zhou等[13]對傳統硝化活性污泥系統的研究發現,DO濃度在0.2～2.0mg/L的范圍內,DO濃度越高亞硝酸鹽氧化速率越快.二者產生差異的原因可能是由于反應體系的不同,本文是在一個以厭氧氨氧化功能為主,多種脫氮功能菌共存的系統內測定的,NOB活性長期受到抑制,因此隨著DO濃度增加亞硝酸鹽氧化速率很低且變化不大.

圖5 NOB活性試驗中不同DO濃度下NO2--N隨時間降解情況Fig.5 Degradation of NO2--N with time under different DO concentrations in NOB activity test

2.3 DO濃度對好氧氨氧化和厭氧氨氧化過程的影響

2.3.1 不同DO濃度下僅投加NH4+-N時氮濃度變化情況 由于原水中無可利用的 COD,試驗過程中忽略異養反硝化作用.整個試驗過程中NO2--N積累量很小,由2.2.3可知系統內NOB活性極弱,因此忽略 NOB氧化的 NO2--N.NH4+-N降解的量遠大于NO2--N生成的量,再根據總氮損失和 pH值變化情況分析發現,NH4+-N主要通過兩種途徑去除,分別為AOB的好氧氨氧化作用和AnAOB的厭氧氨氧化作用.在長期穩定運行的厭氧氨氧化系統內,AOB活性被抑制,但是當供給充足的NH4+-N以及一定的溶解氧條件時,AOB表現出活性,將NH4+-N氧化為NO2--N后,由于系統內存在大量活性較高的AnAOB,AnAOB利用剩余 NH4+-N和產生的NO2--N進行厭氧氨氧化反應.基于厭氧氨氧化微生物代謝[16]等式中的化學計量關系和式（1）～（3）可以分別計算出AnAOB和AOB降解的NH4+-N濃度.

圖6 不同DO濃度下僅投加NH4+-N時氮素濃度的變化Fig.6 Variation of nitrogen concentrations when substrate is ammonia under different DO concentrations

由NH4+-N降解和NO3--N生成情況可以看出,前 30min反應速率較快.李健敏[23]在研究厭氧氨氧化濾池氮素轉化途徑時也出現了類似的現象,僅投加 NH4+-N,同時控制 DO 濃度為 2.5～3.5mg/L,結果表明前30min NH4+-N降解速率最快,30min后反應速率變慢.整個試驗過程中AOB具有充足的反應條件,由此推測產生這種現象的原因與DO對AnAOB的抑制作用有關.DO抑制厭氧氨氧化活性的主要原因是氧分子參與生成的某些氧化物和自由基[24]對AnAOB具有抑制作用,因此推測氧分子在參與生成這些抑制性因子與產生抑制作用之間具有時間差,產生了“滯后性抑制”的現象.李亞峰[20]的試驗在Anammox-UASB反應器中進行,反應器分別采用進水脫氧和不脫氧的方式運行,結果表明在進水不脫氧的條件下,觀察到反應器第 1d NH4+-N去除率高達80.27%,反應進行到第9d去除率下降為55.91%,可見DO對AnAOB的抑制作用根據反應器以及運行條件的不同,具有不同的滯后性抑制時間.此外,由NH4+-N降解情況可以看出,在 DO為 0.4mgO2/L時,AOB與AnAOB的協同作用最好,NH4+-N降解速率最快,這可能與微生物長期生活的有氧環境有關.

2.3.2 不同DO濃度下AOB的比氨氧化速率及氧半飽和常數 濾池進水的DO濃度為4.0～5.0mg/L,由于反應器采用上流式運行方式,因此濾池下部DO濃度相對較高,為AOB的生長提供了良好的環境條件.間歇試驗所用濾料長期處于0.4～1.0mg/L的DO環境中.圖7給出了不同DO濃度下AOB比氨氧化速率,并用Origin軟件擬合Monod方程得出了AOB氧半飽和常數 KO2,AOB.從圖中可以看出,當 DO 在0.2～1.5mg/L范圍內,DO濃度越高,比氨氧化速率越大;KO2,AOB為 0.106mgO2/L,表明在長期不控制進水溶解氧的 Anammox濾池內,AOB對氧的親和力很高.本試驗與 Fan等[25]的研究結果相似,在低 DO（0.5mgO2/L）條件下長期運行的活性污泥系統中,KO2,AOB為0.14mgO2/L.Zhang等[26]利用硝化生物膜反應器,測得不同大小絮狀污泥（70～155μm）的KO2,AOB在0.15～0.76mgO2/L范圍內,較小的絮狀污泥對氧的親和力更高,本試驗結果與70μm絮狀污泥的KO2,AOB（0.15mgO2/L）相近.與 Reto等[27]在中試活性污泥反應器中測得的 KO2,AOB（0.79mgO2/L）相比,本研究中AOB對氧的親和力更高,這可能是由于中試活性污泥系統中絮狀污泥較大,受到了傳質阻力的影響.楊慶等[28]在研究中指出,氧半飽和常數不是一個固定不變的值,長期環境的適應會產生不同的氧半飽和常數.Sin等[29]在研究中也曾明確提出,反應器的類型、反應體系以及運行參數的不同都會導致氧半飽和常數有很大的差異.

圖7 AOB的Monod擬合方程Fig.7 The fitting Monod equation of AOB

2.3.3 不同 DO濃度下 AnAOB的比氨氧化速率 由式（2）可以計算出各DO濃度下AnAOB的比氨氮降解速率.當DO為0.4mg/L時,AnAOB的比氨氮降解速率最大,為 0.9mgN/（gVSS·h）;當 DO 大于0.4mg/L時,反應速率隨著DO濃度增加而略微減少;當DO為1.5mg/L時,仍能達到0.6mgN/（gVSS·h）.表明在進水未脫氧的Anammox濾池中,AnAOB對DO的耐受力較高,這是由于生物膜系統內氧的傳質阻力高于活性污泥[30].楊玉兵等[31]對 Anammox濾池的研究中也提出,長期環境適應使濾池中 DO不會對AnAOB產生明顯抑制作用,相反控制進水DO濃度后,厭氧氨氧化脫氮效率短期內有所降低.

此外,對比發現,各DO水平下,AOB比氨氮降解速率均大于 AnAOB比氨氮降解速率.賈方旭等[32]對厭氧氨氧化菌種間關系的研究中指出,當提供了一定的 DO條件,在 AOB和 AnAOB的競爭關系中,AOB會獲得更多的基質和空間.從菌群競爭角度來看,導致了上述結果.同時,本文結果也表明,DO 濃度對于菌群之間的協同競爭作用至關重要.

3 結論

3.1 長期穩定運行的Anammox濾池是以AnAOB為主,多種脫氮功能菌共存的混合系統,厭氧氨氧化活性較高,SAA為5.3mgN/gVSS·h;AOB和DNB也具有一定活性;而NOB基本檢測不到活性.

3.2 Anammox濾池在進水未脫氧的條件下運行,KO2,AOB為（0.106±0.010）mg/L,系統內AOB對氧具有極高的親和力.當反應底物僅投加 NH4+-N時,厭氧氨氧化生物膜系統出現一體化脫氮現象.

3.3 Anammox生物濾池中AnAOB對溶解氧的承受能力較強.