50種常用香料對銅綠微囊藻的生態毒性效應

張薛薇,開振鵬,宋衛國,陳珊珊（1.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海 01403；.上海應用技術大學化學與環境工程學院,上海 01418；3.上海市農產品質量安全評價專業技術服務平臺,上海 01106）

香料是一類被人們嗅覺或味覺感知的特殊香味的物質.由于具有使人身心愉悅的功能,被廣泛應用于食品、飲料、化妝品、洗滌用品、醫藥、皮革、織物等行業的各類產品中.由于天然香料資源稀少、價格昂貴,以人工合成香料代替天然香料的做法較為流行.隨著物質生活水平的不斷提高,世界香料產品的消耗量和產量逐年遞增.香料也通過生活污水、工業污水系統以及地表徑流排放到環境中.許多研究者們曾報道,不僅能夠在環境中,如在地表水、污泥、大氣及海洋中檢測到各種香料殘留,在生物體內,如魚類、海洋哺乳動物,甚至人體組織和母乳中均已檢測到香料的殘留組分.Simonich等[1]在美國一些主要廢水處理廠中的污水發現 16種香料的殘留量為0.3～154μg/L.Fromme等[2]在柏林的多條河流和沉積物中均檢測到了佳樂麝香（HHCB）和吐納麝香（AHTN）殘留,其中在嚴重污染區域,殘留量為地表水 1.59μg/L,沉積物 0.92mg/kg d.w..除了水體和污泥,Peck等[3]在密爾沃基市南部靠近密西根湖附近收集的空氣樣本,發現超過 80%的樣品中含有合成麝香,其中麝香二甲苯（MX）,麝香酮（MK）為主要污染物.海洋同樣受到了合成香料的污染,Vecchiato等[4]在西西里海峽采集了42個海水樣本中的27個檢測到了合成香料,濃度總和高達 0.112 μg/L.此外,香料可以通過多種途徑進入生物體內.不同實驗室在鯽魚、中華鱘等魚類樣品中也檢測到了多種合成麝香[5-6],海洋哺乳動物體內也多次檢出 HHCB[7-8].早在 1996年,Müller等[9]報道了人體組織中合成麝香化合物的殘留.結果表明所有的樣品中均檢測到合成麝香,其中主要是MK和MX.Moon等[10]收集的43名韓國女性的脂肪組織樣品中均檢測到 HHCB,濃度范圍為 28-211ng/g.Liebl等[11]第一次在母乳中發現合成麝香污染,主要污染物 MX的濃度范圍為10～1220ng/g,平均含量為 100ng/g,此后 Kang 等[12]也報道了韓國婦女血清、臍帶血清以及母乳樣本的合成麝香污染情況.以上研究表明,以合成麝香為主體的香料物質不僅污染水體、海洋、大氣環境,也通過食物鏈最終傳遞到人體組織及母乳,其污染程度已不容忽視.

盡管人們普遍認為香料對生物體沒有明顯毒性,但是越來越多的研究發現,香料尤其是合成香料對多種生物的生長有危害.Gooding等[13]研究了AHTN和 HHCB對淡水貽貝幼體的 LC50值在0.5～2mg/L,濃度為1mg/L的合成麝香會導致貽貝幼體生長緩慢.Wollenberger等[14]的研究也發現合成麝香強烈抑制水蚤的幼蟲發育.合成麝香對脊椎動物有抗雌激素效應（對人的雌激素受體 EC50值在0.009～0.10nmol/L之間）[15].另外多項實驗顯示過多人工香料暴露可能增加癌癥的發生幾率[16].然而,當前香料毒性的研究主要集中在對動物的危害,而對植物和藻類的研究相對匱乏.

銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一種廣泛分布的淡水藍藻,它是造成水體水華的重要藻類,是水生生態系統中的初級生產者,作為一類原核生物,銅綠微囊藻對一些污染物更為敏感.而且由于其容易獲得、個體小、繁殖快,是一種很好的測試生物[17].許多研究者發現雙酚 A,萘、芘、菲,生長素吲哚乙酸等各種有機污染物暴露可對銅綠微囊藻生長產生影響,表現為不同濃度下產生促進或抑制作用[17-19].朱小琴等[20]評價了酚酸類,生物堿類,脂肪酸和酯類共13種化感物質的抑藻效應.結果表明,生物堿類物質對微藻生長的抑制效果最強,其抑制率＞80%.以往這些研究的目的多集中于各類化合物在湖泊富營養化過程中的作用或者化感控藻,進而完成水華控制相關的機理研究,并未以銅綠微囊藻為指示性藻類而研究水體中存在的某一大類污染物對其的生態毒性.因此,本實驗以銅綠微囊藻為受試對象,重點研究 50種常用香料對其生長的影響、葉綠素、蛋白質濃度、抗氧化損傷酶活力等生理指標的變化,豐富香料的毒性數據,以期為全面評估香料的生態環境風險和科學使用香料提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

儀器:紫外-可見光分光光度計（UV1901）,冷凍高速離心機（Centrifuge 5804R）,超聲波細胞破碎儀（JY92-IIDN）,酶標儀（Multiskan FC）,高壓蒸汽滅菌鍋（LDZH-200KBS）,電子分析天秤（XS 105DualRange）,光照培養箱（SPX-300B-G）.

本實驗所用銅綠微囊藻FACHB 905購于中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫.實驗前在BG11培養基擴大培養備用.在無菌條件下,在250mL的錐形瓶中各加入10mL備用藻液和不同含量的香料,最后加入無菌培養基,使培養液總體積為100mL.將接種后的培養基置于無菌光照培養箱中,設置光照強度為 3200lx,溫度（28±0.5）℃,光暗比12h:12h,每日早中晚搖動錐形瓶,并隨機更換位置,防止因光照不均勻帶來影響.

50種供試香料化合物均購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司,純度＞96%（詳見表 1）.分析純試劑乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等購自上海安譜科學儀器有限公司.根據化合物的理化性質和溶解度,分別將各供試香料用上述溶劑溶解,配制成濃度為100mg/L的母液.超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）以及丙二醛（MDA）測定所用的試劑盒購自南京建成生物工程研究所.

1.2 實驗設計

向實驗組中分別加入表1中50種香料化合物,使各實驗組每個錐形瓶中化合物濃度為 0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10mg/L,每組設置5個平行.同時設置不添加香料的對照組,按上述培養條件培養.以9d為實驗周期,每日測定藻密度.

表1 50種香料對銅綠微囊藻生物量增長的抑制率（濃度1mg/L）Table 1 Inhibitory rate of 50kinds of fragrance materials on biomass growth of M.aeruginosa at 1mg/L

續表1

1.3 指標測定

實驗選取了對銅綠微囊藻的生長有顯著抑制作用的4種香料2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚,分別于第3、6、9d時測定葉綠素a、蛋白含量和抗氧化酶活性.這 4種化合物的處理濃度為 1mg/L,每組設置5個平行.設置不添加香料的為空白對照組.

1.3.1 銅綠微囊藻生長測定 每隔24h使用紫外-可見光分光光度計,于OD680處檢測各處理組和對照組藻培養液的吸光度,連續檢測 9d.利用預先測定的藻細胞濃度與吸光度值的相關公式計算微囊藻細胞濃度:

式中:Y為藻細胞數量,106個細胞/mL; X為680nm處的光密度值OD.

1.3.2 葉綠素a含量測定 分別在第3、6、9d于各處理組和對照組藻培養液中取5mL藻液,10000r/min離心10min收集藻細胞,加入5mL 95%乙醇,置于 4℃冰箱黑暗提取 24h,將提取液離心（10000r/min,10min）,取上清液,以95%乙醇作為參比,以665、649nm 下的吸光值計算葉綠素含量.運用以下公式計算葉綠素a的濃度[21]:

1.3.3 粗酶液提取和蛋白質含量測定 在實驗的第3、6、9d于各處理組和對照組藻培養液中取5mL藻液,10000r/min離心 10min,收集藻細胞,加入0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸,4℃細胞破碎儀超聲 5min.細胞完全破碎后,將樣品在 4℃下10000r/min離心10min,取上清液使用酶標儀測定樣品中蛋白質含量.銅綠微囊藻的蛋白質含量測定采用修正的Bradford法[22].

1.3.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量測定 利用1.3.3中提取的粗酶液測定抗氧化酶活性.SOD的活性采用羥胺法測定;POD利用愈創木酚法測定;CAT的測定運用鉬酸銨比色法;MDA采用硫代巴比妥酸TBA比色法測定.以上測定均采用試劑盒完成.

1.4 數據處理

所有實驗數據結果均采用mean±SD的形式表示,運用GraphPad prism 6軟件進行數據分析及單因素方差分析（One-way ANOVA）.

2 結果與討論

2.1 香料對銅綠微囊藻生長的影響

實驗結果顯示在測試濃度下（0.01～10mg/L）大部分香料對銅綠微囊藻的生物量增長（以細胞數計算）均沒有顯著影響.但是在高濃度下,2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚顯著抑制銅綠微囊藻的生長,這4種香料處理組表現為實驗4d后藻細胞濃度顯著低于對照組.本實驗以培養第9d的藻細胞濃度計算不同香料在不同濃度下的抑制率.表 1顯示 46種香料在1mg/L的濃度下對藻的抑制率均低于20%,而2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚的抑制率分別為58.82%、62.09%、79.58%和56.91%.實驗還發現,在處理濃度1mg/L下橙花叔醇、肉桂醇、胡椒酮等對銅綠微囊藻的生長有一定的促進作用,但不顯著.依據不同濃度下生物量增長的抑制百分率,計算出2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚對銅綠微囊藻的生物量增長抑制率半效應濃度 EyC50值分別為1.81,1.26,0.55,1.40mg/L.

為了進一步研究香料對銅綠微囊藻的毒性,實驗測定了有顯著抑制作用的4種香料（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）對銅綠微囊藻葉綠素a、蛋白質濃度和抗氧化損傷酶活力等生理指標的影響.

2.2 香料對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

實驗在第3、6、9d時分別測定了1mg/L的4種香料（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）對葉綠素a含量的影響.圖1顯示,2-甲氧基萘和麝香草酚顯著抑制銅綠微囊藻葉綠素 a的含量（P＜0.0001）;月桂烯能抑制葉綠素 a含量,但抑制能力沒有 2-甲氧基萘和麝香草酚顯著（P＜0.01）;吲哚對葉綠素a的含量無影響（P＞0.05）.2-甲氧基萘和麝香草酚對葉綠素a的抑制率隨處理時間的延長沒有明顯變化,處理 3d至 9d的抑制率分別在 45%～50%和60%～70%.月桂烯處理的銅綠微囊藻3d時葉綠素a的抑制率為52.36%,然后葉綠素a的含量持續升高,在第 9d時抑制率為 11.96%.葉綠素作為光合色素,在藻類光合作用中起關鍵性作用,參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉化.2-甲氧基萘和麝香草酚對銅綠微囊藻光合活性的影響主要體現在影響胞內光合色素的合成,從而影響了藻細胞對碳的固定和同化,導致光能利用效率和轉化效率下降,藻類的光合速率降低,最終對微囊藻造成生長抑制,并且隨著時間的推移抑制率略有升高.

圖1 香料對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Fig.1 Effects of fragrance material on chlorophyll a content of M.aeruginosa

2.3 香料對銅綠微囊藻蛋白質含量的影響

由圖2可見,與對照組相比,1mg/L 的2-甲氧基萘和麝香草酚顯著抑制銅綠微囊藻蛋白質含量（P＜0.0001）;并且隨著時間的推移,抑制作用沒有減弱.月桂烯和吲哚在第3d時有較強的抑制作用（P＜0.01）;但到了第9d,這種抑制作用就不顯著了（P＞0.05）.可見隨著暴露時間的增長,月桂烯和吲哚處理的銅綠微囊藻蛋白質含量逐漸回升.這可能與生物體補償機制有關.在香料的脅迫下,銅綠微囊藻蛋白質合成可能受到抑制,或者香料使得合成的蛋白質降解.實驗結果也顯示不同的香料影響了藻細胞蛋白質合成和代謝不同的位點,使得不同香料呈現出不同的毒理效應.這一結果與金霉素及其異構體降解產物對斜生柵藻可溶性蛋白質的影響類似[23].

2.4 香料對銅綠微囊藻抗氧化酶和丙二醛含量的影響

活細胞中自由基的濃度升高會導致動物衰老,癌癥的發生和免疫缺陷以及細胞膜滲漏,衰老,葉綠素被破壞等.與動物相似,植物具有強大的酶防御系統來處理異生素.植物中的酶促防御包括能夠去除、中和氧中間體的酶,涉及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等.濃度 1mg/L香料暴露下第 3d,銅綠微囊藻 SOD、POD和 CAT活性與空白對照并無顯著差異;至第6和9d時,不同香料暴露呈現出酶活性的變化.香料對銅綠微囊藻的生物量增長的抑制也呈現類似的現象,可見抗氧化酶活性的下降與銅綠微囊藻生長抑制相關.由圖3a至圖3c可知,2-甲氧基萘暴露導致SOD活性顯著降低（P＜0.0001）,其它兩種抗氧化酶則無顯著影響（P＞0.05）;麝香草酚顯著抑制了POD活性（P＜0.0001）;月桂烯也可降低 SOD 活性（P＜0.01）;經吲哚處理的銅綠微囊藻,POD和 CAT的活性顯著低于對照組（P＜0.0001）.由于化合物結構差異,不同的香料會影響藻細胞中不同的抗氧化酶,進而干擾胞內正常的生理代謝水平.該結果與金霉素及其異構體降解產物對斜生柵藻抗氧化系統的不同影響類似[23].

MDA是一種在逆境脅迫下產生的脂質過氧化產物,其含量可指示細胞膜脂過氧化水平,并作為藻體受脅迫程度的標志.由圖 3（d）可知,4個處理組MDA 含量均高于對照組（P＜0.05）.對照組的含量為1.68～1.85nmol/g,而處理組 MDA 含量在 2.10～2.22nmol/g之間.該結果證實了經上述4種香料暴露的藻細胞內產生了氧化應激的變化.香料會破壞抗氧化酶防御系統,使抗氧化酶的合成受到抑制,細胞內過量的活性氧（ROS）無法及時排除,誘導細胞膜發生膜質過氧化作用,引起 MDA 大量積累,最終導致死亡.

2.5 香料對銅綠微囊藻生長影響機理初探

具有強烈的類似橙花香氣的 2-甲氧基萘被廣泛用于香皂、花露水和古龍香水.在本實驗條件下,2-甲氧基萘顯著抑制了微囊藻葉綠素a和蛋白質含量,降低了SOD酶的活性.在原核細胞和葉綠體中主要存在Fe-SOD,它們可以有效地清除超氧陰離子自由基,避免對細胞過度的損傷,維持葉綠體功能.因此,我們推斷2-甲氧基萘可能是通過抑制SOD酶活性,影響了微囊藻葉綠素 a和蛋白質含量,進而抑制了微囊藻的生長.本文研究結果與王秀翠等[19]報道的2-甲氧基萘類似物萘的暴露能顯著降低銅綠微囊藻葉綠素 a含量,最終抑制藻類生長的結果一致.本實驗中麝香草酚也可能是通過抑制POD的活性,影響了微囊藻的光合作用,導致藻類的死亡.沈青山等[24]研究表明高濃度的麝香草酚可以誘導黃曲霉孢子生產大量的ROS和NO達到殺菌效果,與本實驗麝香草酚破壞藻類抗氧化酶防御系統,產生氧化應激反應的現象類似.從實驗結果可以看出月桂烯也可以抑制SOD酶活性,使得藻細胞積累大量ROS,使葉綠素的濃度降低,影響藻細胞的光合作用,最終引起藻類死亡.與上述 3種香料不同,吲哚對銅綠微囊藻葉綠素 a的含量沒有顯著影響,它主要是抑制了POD和CAT酶的活性,導致細胞內ROS的大量積累,引起藻類死亡.Lee 等[25]發現吲哚通過調控傳感器蛋白 SidA,影響 SidA介導的一系列轉錄,下調抗酸性基因表達,抑制大腸桿菌生物膜形成.而內源性氧化脅迫也會抑制大腸桿菌細胞膜的形成[26].因此,我們推斷高濃度的吲哚可以抑制藻的抗氧化酶活性,使得藻細胞積累大量ROS,影響生物膜形成,達到抑制銅綠微囊藻生長的效果.不同的香料對銅綠微囊藻的作用機理存在差異,但是這 4種香料都能破壞微囊藻的抗氧化酶系統,導致細胞內ROS大量累積,進而抑制藻類生長.不同的是,2-甲氧基萘、麝香草酚和月桂烯可能是抑制了藻類光合作用;吲哚可能是干擾了細胞膜的形成.2-甲氧基萘、麝香草酚和吲哚屬于芳香族化合物,月桂烯為烯烴類化合物,不同結構的香料對不同的抗氧化酶活性的影響也不一樣.

當前人們普遍認為大部分香料對生物體沒有毒性或毒性較低,而香料對植物的影響也少有人關注.本研究表明部分香料可以通過抑制藻細胞抗氧化酶活性,破壞葉綠素含量和功能,進而導致藻類生長異常.環境中香料殘留的來源主要是生活和工業污水.現行污水處理并沒有考慮到去除其中可能的香料殘留[27].某些香料（如多環麝香等）屬于持久性有機污染物,環境中難降解,容易產生生物富集.研究發現國內人口密度高的大中型城市河流沉積物中多環麝香污染相當嚴重,城市污泥中（干物質量）殘留量達到769mg/kg[27],污水中殘留量為0.005～0.55mg/L[27-28].本實驗發現在50種常用香料中有4種（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）對銅綠微囊藻的生長有顯著的抑制作用.由于在食物鏈底端的藻類對整個生態系統起著至關重要的作用,因此香料對藻類的影響也應該受到關注.

3 結論

3.1 盡管本文所研究的50種香料大部分對銅綠微囊藻的生長沒有顯著影響,但是實驗發現 2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚在 1mg/L暴露濃度下能顯著抑制銅綠微囊藻的生長,并表現出明顯的劑量-效應關系,EyC50值分別為 1.81,1.26,0.55,1.40mg/L.

3.2 這4種香料通過抑制藻細胞抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性,過量累積MDA,破壞葉綠素含量和功能,進而導致藻類生長異常.不同結構的香料影響不同的抗氧化酶活性.其中2-甲氧基萘、麝香草酚和吲哚均屬于芳香族化合物.作為香料中的一大類芳香族化合物,由于具有獨特的芳香氣味,被廣泛應用.但是芳香環性質穩定、難降解,對環境藻類有潛在危害,因此我們需要更多關注芳香類香料的生態安全性.