丹參提取物對放射性肺損傷大鼠的保護作用研究

陳巖巖 周淑娟 夏玉朝 薛曉拉

放射性肺損傷(Radiation-induced Lung Injury，RILI)是乳腺癌、肺癌、食管癌等胸部腫瘤放療中最為普遍和嚴重的并發(fā)癥。當胸部照射劑量超過肺組織閾值時，會損傷肺組織，初期主要是炎癥發(fā)生，后期遷延加深會導致纖維化的發(fā)生[1]。放射性肺炎(RP)是RILI的早期表現(xiàn)，在高劑量照射后的3個月后即可發(fā)生急性RP；放射性肺纖維化(RF)是RILI的晚期表現(xiàn)，通常在數(shù)個月或數(shù)年后出現(xiàn)，時間界限不等。目前，急性RP的發(fā)生率高達5%～30%。RILI嚴重影響腫瘤靶區(qū)的照射劑量，減低腫瘤局部控制率，對腫瘤的放療效果影響巨大，輕則導致放療中斷，嚴重者可引起肺功能衰竭而死亡[2]。RILI是多種因素綜合調控的的復雜過程，西醫(yī)治療效果不甚理想。中醫(yī)認為RILI從屬“火熱毒邪”、“燥邪”，總結其病機總屬為火熱之邪或燥邪損傷血絡，耗傷氣陰，火熱蘊結，以養(yǎng)陰、活血及清熱解毒為主要方法[3]。臨床研究證實[4]， 中藥提取物對放射所導致的肺損傷具有一定的效果，同時具有保護肺組織、滋陰清肺的作用，副作用小。丹參是傳統(tǒng)上治療心血管疾病的主要藥物，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其還具備抗菌、抗炎、抗腫瘤、保護器官等作用[5]。本次研究就丹參提取物(丹參酮和丹酚酸類)對放射性肺損傷大鼠的作用進行研究和觀察，探討其在預防及控制放射性肺損傷中的作用機制報告如下。

資料與方法

一、實驗儀器和材料

HM-MD-I放射治療模擬機、HM-J-16-I中高能雙光子醫(yī)用電子直線加速器購自江蘇海明醫(yī)療器械有限公司；電腦半自動石蠟切片機購自浙江金華惠友儀器有限公司；ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)；顯微鏡購自上海測維光電技術有限公司；賽默飛世爾(Thermo Scientific)酶標儀、移液器購自上海沃元科技有限公司；TG16臺式高速離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；生理鹽水、二甲苯、多聚甲醛、無水乙醇、10%水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司；ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；丙二醛(MDA)測試盒購自南京建成生物工程研究所；

二、實驗動物

共90只無特定病原體(SPF級)8周齡雄性SD大鼠，體重(195±15)g由省動物實驗中心提供。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人負責管理。實驗室定期消毒，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。飼養(yǎng)1周無異常后開始實驗，所有操作均遵循《實驗動物保護條例》。

三、方法

1 分組方法和模型制備 將所有實驗大鼠隨機分為3組，每組各30只。A組為空白對照組，不進行照射；B組為單純照射組；C組為照射加丹參提取物組。B、C組大鼠取仰臥位，10%水合氯醛麻醉，四肢固定，充分暴露胸部進行照射，避免其他部位暴露。照射劑量12Gy，照射范圍為大鼠右側胸部，包括大鼠前肢兩腋窩中點連線至劍突水平。分別在X線照射4周、8周、12周后各取10只大鼠心臟采血后處死、取材。

2 丹參提取物制備 丹參藥材由醫(yī)院中藥房提供，切斷成片狀后使用75%乙醇回流提取丹參，質量比為10 ∶1，提取時間為15 min，重復提取3次。合并濾液后得到丹參提取液，減壓回收溶劑得到無醇味浸膏，蒸餾水洗滌10次左右后噴霧干燥，獲得丹參提取物。

3 給藥方法 A、B組大鼠按照體質量給予生理鹽水灌胃，標準為1.5 mL/200 g，使用適量鹽水將丹參提取物配比為懸浮液，C組以相同標準給予丹參提取物灌胃。連續(xù)灌胃1周后，B、C組給予X線照射。照射后各組繼續(xù)按上述方法灌胃2周，期間觀察大鼠活動情況并按周對大鼠體質量進行稱重，根據(jù)體質量調整灌胃劑量。

4 樣本采集和檢測方法 10%水合氯醛麻醉后心臟穿刺取血5 mL。血液樣本置于肝素抗凝管內，3 000 r/min離心分離15 min，取上清液低溫保存，待全部取材后同時進行檢測。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清學指標[6]：白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、生長轉化因子β(TGF-β1)。開胸后清除胸肋骨，使胸腔完全暴露，迅速摘取肺組織，取右上肺組織，0.9%生理鹽水沖洗干凈，10%甲醛溶液固24 h，石蠟包埋，常規(guī)切片后HE染色觀察病理改變。采用ELISA法檢測S0D含量，硫代巴比妥酸化學比色法測定MDA含量。右肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體質量(g)×100%，肺系數(shù)越高表示肺纖維化程度越高。采用熒光定量PCR檢測NF-κB水平，提取肺組織RNA，逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀進行擴增。2-△△cT法計算目的基因相對表達量，引物序列如下： NF-κB p65上游：5′-AACAACACAGACCCAGGAGT-3′，下游：5′-CTGTCACCAGGCGAGTTATAG-3′Ⅲ。

四、觀察指標

① 血清學指標：IL-6、TNF-α、TGF-β1；② 大鼠血清SOD活性變化；③ 大鼠右肺系數(shù)；④ 大鼠肺組織MDA含量；⑤ 大鼠肺組織NF-κB p65表達。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、血清學指標變化比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯高于A組(P<0.05)；C組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 各組IL-6、TNF-α、TGF-β1表達變化比較

二、肺組織SOD活性變化比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織SOD活力與A組相較有明顯下降(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織SOD活力明顯高于B組(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織SOD活性變化比較

三、肺組織MDA含量比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織MDA含量與A組相較有明顯提高(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織MDA含量明顯低于B組(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠肺組織MDA含量比較

四、右肺系數(shù)比較

4周、8周后，與B組比較，C組大鼠右肺系數(shù)比B組有明顯下降(P<0.05)；12周后3組大鼠右肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠右肺系數(shù)比較

五、肺組織NF-κB p65相對表達量比較

B組和C組大鼠照射4周、8周、12周后肺組織NF-κB p65相對表達量與A組相較有明顯提高(P<0.05)；C組大鼠各期肺組織NF-κB p65相對表達量明顯低于B組(P<0.05)(見表5)。

表5 各組大鼠肺組織NF-κB p65相對表達量比較

討 論

惡性腫瘤的發(fā)病率不斷上升導致越來越多的患者進行放射治療，因此帶來的RILI對患者的健康和生活質量的嚴重影響逐漸獲得重視。關于RILI的發(fā)病機制目前尚未完全明確，其發(fā)生與多種細胞因子如IL-6、TNF-α、TGF-β1等密切相關，因此“細胞因子級聯(lián)”學說是當前比較認可的一種學說。RILI可分為早期RP和晚期RF，晚期RF一旦形成會造成不可逆的損傷，嚴重影響患者健康，威脅患者生命。由此可見，預防和放射前提前用藥干預比后續(xù)治療效果更佳。

多種研究顯示[7-8]，RILI的發(fā)生是炎性細胞、肺泡上皮細胞和成纖維細胞，多種細胞因子共同作用而導致，對于細胞IL-6、TNF-α、TGF-β1等多種細胞因子的研究能夠較好的體現(xiàn)放射性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展的過程。因此對于IL-6、TNF-α、TGF-β1的監(jiān)測對于RILI具有很好的預測作用。西醫(yī)對于RILI的治療一般給予吸氧、止咳、平喘等對癥治療，急性期癥狀嚴重者給予腎上腺皮質激素治療，但未能取得很好的治療效果，且無法發(fā)揮預防作用。在中醫(yī)理論中，RILI應屬于肺痿、喘證的范疇，整體表現(xiàn)為骨髓抑制、免疫功能下降、肺組織纖維化，局部表現(xiàn)為喘息、咳嗽、呼吸困難等癥狀[9]。研究證實[10]，中醫(yī)藥對于相關致炎和致纖維化因子的表達有明顯抑制作用，可減輕放射性肺損傷急性期的炎癥反應，延緩放射性肺損傷纖維化的進展。本文主要針對丹參提取物對放射性肺損傷大鼠的保護作用展開研究。

丹參是我國傳統(tǒng)中藥，味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰之功?，F(xiàn)代中醫(yī)藥研究表明，丹參具有抗炎、保護血管內皮細胞、減輕細胞凋亡、促進組織修復與再生，抗纖維化等作用。脂溶性的二萜醌類化合物以及水溶性的酚類成分是丹參主要化學成分。丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮及其異構體為脂溶性成分，原兒茶醛、丹參素、迭香酸、丹參酚酸等為水溶性成分。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，在抗纖維化作用方面，丹參對雞胚絨毛尿囊膜及轉基因斑馬魚新生血管的活性具有很好的抑制作用，并且對血管內皮細胞功能有很好的調節(jié)作用。對丹參提取物的檢測發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B增加了血清清除自由基(SOD)能力，降低了脂質過氧化副產物(MDA)水平[9]。SOD具有清除機體內過多的超氧負離子自由基的能力，檢測組織中SOD的活力水平能夠了解機體組織對氧化物、自由基等的清除能力。機體內MDA的含量可間接反映體內S0D活力，反映體內脂質氧化程度，了解機體氧化一抗氧化系統(tǒng)能力。本次研究結果顯示，C組SOD活性水平明顯高于B組，MDA含量明顯低于B組(P<0.05)，與其他學者研究結果基本一致[11]。IL-6是具有代表性的炎性因子，具有增強NK細胞活性、誘導急性期反應分子并刺激肝細胞的作用；TNF-α是一種強力促炎性反應細胞因子，作為體內細胞因子調解啟動因子在刺激炎性細胞趨化反應、改變血管內皮通透性等方面發(fā)揮強大的局部作用；TGF-β1由多種細胞分泌產生，能使正常的成纖維細胞的表型發(fā)生轉化，現(xiàn)已成為RILI防治的新靶點，多種研究均表明干預TGF-β1信號通路能夠減輕RILI的發(fā)生，降低血清中TGF-β1的水平對于RILI的防治具有重要作用[12]。本次研究結果表明，C組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示丹參提取物能夠有效減輕炎性反應、抑制纖維化。NF-κB 作為核轉錄因子，在炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展過程中具有十分重要的調控作用，能夠經由降低 NF-κB的轉錄來對肺損傷以及肺纖維化產生抑制作用[13]。本次研究結果顯示，C組大鼠各期肺組織NF-κB p65相對表達量明顯低于B組(P<0.05)，提示丹參有效降低NF-κB p65的轉錄，為RILI患者提供保護。通過對各組大鼠不同階段右肺系數(shù)的對比發(fā)現(xiàn)，丹參提取物能夠降低實驗大鼠右肺指數(shù)，從而降低肺部病理損傷，最終發(fā)揮抗纖維化的作用。

通過上述研究總結，丹參提取物對RILI的機理主要有：①保護血管內皮細胞，改善血液循環(huán)，降低血管通透性，抑制血小板聚集，減輕肺水腫和纖維化的發(fā)生；②抑制TNF-α、TGF-β1等表達，減輕炎癥及纖維化病變；③增強抗氧化和清除自由基作用，降低射線引起的過氧化損傷，抑制成纖維細胞增殖。但是丹參酮類化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺點[14]，臨床應用受到限制。

綜上所述，丹參提取物對RILI具有良好的保護作用，能夠顯著降低血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，提高血清SOD活性水平，降低肺組織織MDA含量、NF-κB p65表達和右肺系數(shù)，減少相關炎癥的發(fā)生，預防肺纖維化。