LncRNA CASC7與miR-27b-3p在肺結核外周血單核細胞中的表達及意義

肖歡容 王少鋒 蔡志鋼

肺結核是我國臨床常見的一種慢性傳染病，其主要病因為結核分枝桿菌，且已嚴重威脅人類身體健康，因而尋找肺結核相關基因及快速診斷對提高肺結核治療效果具有重要意義[1]。單核細胞在機體免疫及免疫應答過程中發揮重要作用，并可作為感染防御中的第一道防線，其可通過清除結核分枝桿菌從而發揮作用[2]。長鏈非編碼RNA在肺結核患者中異常表達并可能作為診斷肺結核的重要輔助標志物[3-4]。長鏈非編碼RNA CASC7(LncRNA CASC7)在缺血再灌注損傷大鼠中表達水平降低，上調其表達可抑制神經元細胞凋亡[5]。生物信息學分析顯示微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)可能是CASC7的靶基因，研究表明miR-27b通過下調TET2表達而促進ox-LDL誘導的內皮細胞炎癥反應及細胞凋亡[6]。但CASC7是否通過調控miR-27b-3p的表達從而參與肺結核發生過程尚未闡明。因此，本研究主要探討CASC7與miR-27b-3p在肺結核外周血單核細胞中的表達及其意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年3月至2019年10月本院收治的肺結核患者120例為研究組，所有患者均符合中華醫學會《臨床診療指南:呼吸病學分冊》相關診斷標準[7]。經痰涂片檢查顯示均為陽性，且肺部無其他細菌、真菌及病毒感染，患者均無合并心、肝、腎等臟器疾病，其中男70例，女50例，年齡48～75歲，平均年齡(59.63±8.59)歲。根據活動性肺結核診斷標準將肺結核患者分為非活動性肺結核組60例、活動性肺結核組60例[8]，其中活動性肺結核患者治療方案為2HREZ/4HR。同時選取同期健康體檢者60例為對照組，其中男30例，女30例，年齡50～70歲，平均年齡(60.21±9.25)歲。排除標準：合并自身免疫性疾病；合并腫瘤患者。各組研究對象年齡(t=0.416，P=0.678)、性別(=1.125，P=0.289)比較差異無統計學意義，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

二、主要試劑及儀器

Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invotrogen公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；miR-27b-3p寡核苷酸模擬物(miR-27b-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、CASC7小分子干擾RNA(si-CASC7)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；結核菌強毒株H37Rv與弱毒株H37Ra購自美國ATCC公司；CD14+免疫磁珠購自德國Miltenyi公司；7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；MACS自動磁珠分選儀購自上海秉新生物科技有限公司。

三、方法

1 分離外周血單核細胞

分別抽取所有研究對象外周血5 mL，采用肝素鋰抗凝，應用密度梯度離心法分離外周血單核細胞，細胞計數(1×107個/mL)，加入CD14+免疫磁珠(5 μL)，置于4 ℃冰箱內孵育20 min，應用MACS自動磁珠分選儀分離CD14+單核細胞。

2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測CASC7與miR-27b-3p的表達水平

采用Trizol法提取單核細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，按照試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，用2-ΔΔCt法計算CASC7與miR-27b-3p相對表達量。

3 體外驗證實驗[9]

H37Rv、H37Ra分別感染單核細胞，置于培養箱內孵育90 min，取出細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，qRT-PCR法檢測CASC7與miR-27b-3p相對表達量。

4 雙熒光素酶報告基因檢測CASC7與miR-27b-3p的靶向關系

利用基因突變技術將結合位點進行突變，將結合位點與突變位點載入熒光素酶報告基因載體分別構建野生型載體WT-CASC7與突變型載體MUT-CASC7，分別將miR-NC、miR-27b-3p mimcs與WT-CASC7、MUT-CASC7共轉染至人單核細胞，置于培養箱培養24 h，檢測各組熒光素酶活性。

四、統計學處理

結 果

一、體外實驗驗證CASC7與miR-27b-3p的表達量

與感染前比較，H37Rv、H37Ra感染后單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 體外實驗驗證CASC7與miR-27b-3p的表達量

二、CASC7靶向調控miR-27b-3p

LncBase v.2預測顯示CASC7與miR-27b-3p存在靶向結合位點(見圖1)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示miR-27b-3p過表達可明顯抑制野生型載體WT-CASC7的熒光素酶活性(P<0.05)(見表2)。CASC7負向調控miR-27b-3p的表達(P<0.05)(見表3)。

圖1 CASC7的序列中含有與miR-27b-3p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 CASC7靶向調控miR-27b-3p的表達

三、肺結核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

與對照組比較，研究組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 肺結核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

四、活動性肺結核與非活動性肺結核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

與非活動性肺結核組比較，活動性肺結核組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表5)。

表5 活動性肺結核與非活動性肺結核患者外周血單核細胞中CASC7與miR-27b-3p的表達量

五、ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結核的診斷價值

ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結核的診斷價值，結果顯示CASC7診斷時敏感度為57.50%，特異度為91.67%，AUC面積為0.781，95%CI：0.713-0.839，截斷值為0.85；miR-27b-3p診斷時敏感度為57.50%，特異度為81.67%，AUC面積為0.665，95%CI：0.591～0.733，截斷值為1.08；聯合檢測時敏感度為96.67%，特異度為60.00%，AUC面積為0.802，95%CI：0.736～0.858，截斷值為0.51(見圖2)。

圖2 ROC分析CASC7與miR-27b-3p對肺結核的診斷價值

討 論

CASC7可通過調節miR-21的表達而抑制心肌缺血再灌注大鼠的心肌細胞凋亡[10]。CASC7通過靶向miR-21而抑制PI3K / AKT信號通路從而增強嚴重哮喘患者糖皮質激素的敏感性[11]。CASC7還可在神經母細胞瘤等腫瘤中異常表達，并可參與腫瘤發生及發展過程[12]。本研究結果顯示肺結核患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平降低，提示CASC7在肺結核發生過程中可能發揮重要調控作用。進一步研究顯示活動性肺結核組患者外周血單核細胞中CASC7的表達水平低于非活動性肺結核組，提示CASC7水平高低可能用于判斷肺結核疾病嚴重程度或疾病進展。同時本研究采用ROC分析CASC7對肺結核的診斷價值，結果顯示敏感度與特異度較高，提示CASC7對肺結核具有一定診斷價值。但單項檢測具有一定假陽性或假陰性，而兩項或多項聯合檢測可提高診斷效率。

本研究結果顯示肺結核患者外周血單核細胞中miR-27b-3p的表達水平升高，進一步分析顯示活動性肺結核患者外周血單核細胞中miR-27b-3p的表達水平高于非活動性肺結核患者。miR-27b-3p在急性缺血性卒中患者中表達水平升高，并可能作為診斷急性缺血性卒中的生物標志物[13]。miR-27b-3p過表達可減輕心房纖維化[14]。miR-27b-3p通過靶向HIPK2而抑制類風濕關節炎中的軟骨細胞凋亡[15]。表明miR-27b-3p在炎癥性疾病中高表達，并可能發揮重要調控作用。本研究結果提示miR-27b-3p在肺結核發生及發展過程中可能發揮重要調控作用。進一步分析顯示CASC7與miR-27b-3p聯合檢測可明顯提高敏感度。目前關于CASC7與miR-27b-3p在肺結核發生及發展過程中作用機制尚未見相關報道，本研究通過體外實驗證實H37Rv、H37Ra菌株可明顯抑制CASC7的表達及促進miR-27b-3p的表達，分析原因可能是單核細胞在結核菌感染過程中發揮重要作用，而肺結核患者單核細胞中CASC7、miR-27b-3p分子的差異表達，可準確反映單核細胞感染結核菌后機體出現免疫應答反應，因而CASC7、miR-27b-3p可能作為診斷肺結核的潛在生物標記，并可能作為肺結核靶向治療的潛在靶點。同時本研究采用雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實CASC7可靶向結合miR-27b-3p，并可負向調控miR-27b-3p的表達。提示CASC7可能通過負向調控miR-27b-3p的表達從而參與肺結核發生及發展過程。(過多的描述了本文的研究結果，而沒有與以往研究進行機理上或者不同疾病中發揮作用的對比)回復：CASC7與miR-27b-3p在肺結核發生及發展過程中作用機制撒尚未見相關報道。

綜上所述，肺結核外周血單核細胞中CASC7的表達水平降低，miR-27b-3p的表達水平升高，二者聯合檢測可提高肺結核診斷效率，CASC7可能作為肺結核治療的潛在靶點，但關于CASC7在肺結核患者體內表達降低是否與細胞凋亡有關，及其具體作用機制仍需深入探究。