抗人球蛋白檢測試劑注冊性能評估研究要點

關紅 董勁春 國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心 （北京 100081）

內容提要： 抗人球蛋白檢測試劑作為高風險體外診斷試劑，有重要的臨床檢測意義。基于該類試劑自身特點，文章旨在通過對產品注冊申報過程中原材料研究、反應體系、性能評估、陽性判斷值研究及說明書撰寫規范等部分資料要求進行解析，以期對產品的研發和注冊工作提供一些思路和幫助。

抗人球蛋白試驗也稱Coombs試驗，是臨床上進行血型血清學檢測的經典方法，包括直接抗人球蛋白試驗（Direct Anti-Globulin Test，DAT）和間接抗人球蛋白試驗（Indirect Anti-Globulin Test，IAT），主要用于不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測等[1]。抗人球蛋白試驗與輸血密切相關，有重要的臨床意義。常用檢測方法有鹽水法、聚凝胺法、微柱凝膠法等[2-4]。其中抗人球蛋白微柱凝膠法近年來在臨床中應用較多，是集離心技術、生物化學凝膠過濾技術及免疫化學抗原抗體反應三者結合的產物，操作簡便，結果易讀[5-7]。目前已有多家國產和進口企業的相關產品批準上市，并有多家企業處于研發或申報階段。但該類產品具有較高的個人風險，出現錯誤結果易對個人健康安全造成嚴重威脅，作為第三類體外診斷試劑進行管理應進行充分的安全有效性驗證。結合審評經驗和相關指南，本文將對注冊申報重點技術要求進行分析，為研發和相關工作人員提供思路。

1.主要原材料研究

以微柱凝集法為例，該類產品主要原材料主要包括抗體、填充物、填充緩沖液、液體試劑稀釋液等。注冊申報資料中應詳細描述原材料的選擇研究、質量標準等資料，自制材料還應提交制備原理、詳細的生產及鑒定過程。

抗體是抗人球蛋白檢測試劑的核心原材料，很大程度上影響產品靈敏度和特異性，且鑒于該類產品具有較高的個人風險，因此應對抗體的物理指標如純度、濃度以及功能性指標如靈敏度、特異性、效價等基本性能進行充分驗證。

靈敏度和特異性研究至少應選取7種臨床有意義的已知血型系統，如Rh、MNS、Kidd血型系統等。效價研究可采用倍比稀釋方法驗證。

2.反應體系研究

相較于試管法，抗人球蛋白檢測試劑操作更為簡單，實驗過程中干擾因素較少，主要的樣本處理和反應過程研究包括：

2.1 紅細胞制備要求

如洗滌次數、紅細胞濃度范圍確定、加樣量的確定。此外，紅細胞配制如采用LISS液而非生理鹽水，還應明確確配合使用的LISS液的基本信息如生產廠家、規格、貨號、注冊證號。

2.2 孵育條件要求

主要包括溫度、時間的選擇。

2.3 離心條件

離心條件受填充物粒徑等的影響，通過對離心力選擇研究，建議以離心力或固定離心機型號固定轉數和時間的方式設置。

3.分析性能評估（間接抗人球試驗）

3.1 配合使用的試劑

產品性能研究中所采用的各種儀器、試劑或其他物品（如LISS液、抗體篩查紅細胞、血型抗體等）如可能均應采用境內或境外已批準上市的產品，并明確生產廠家、規格、貨號、注冊證號等信息。以LISS液為例，在產品說明書中聲稱的配套產品，應在反應體系研究、性能評估、注冊檢測、臨床試驗等資料中一致。

3.2 靈敏度與特異性

除ABO血型系統外，目前已發現多種其他血型系統，如Rh、MNS、Kidd、Diego、Duffy、Lewis、Kell和Kx等，靈敏度和特異性應至少選擇7種臨床有意義的血型系統進行充分驗證[8]。

3.3 重復性

可選擇有代表性的IgG性質血型抗體如抗D、抗Jka/Jkb、抗Fya/Fyb對批內、批間、日間進行重復性驗證，檢測結果凝集強度差異建議不超過1+。

3.4 干擾驗證

應至少采用強、中、弱性質的抗體，對常見內源性干擾如溶血、脂血、黃疸進行評估，并具體描述采用的抗體。

3.5 臨床樣本驗證

上述研究均采用試劑紅細胞進行研究，在性能評估中應充分評估復雜臨床樣本和臨床環境中可能面臨的各種問題，因此另需通過真實臨床樣本進行檢測靈敏度和特異性的評價，應考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來源，應包括陽性和陰性病例。

3.6 其他

每個預期用途均應進行完整性能評估并應至少包括50例陽性病例。應注意所有試驗結果均應以凝集強度而非陰陽性表示。

3.7 直接抗人球蛋白試驗

使用被不規則抗體和/或C3d致敏的紅細胞進行反應，評價產品性能，適用的性能評價內容可以參照間接抗人球蛋白試驗。

4.陽性判斷值

紅細胞表面已結合的抗體和/或補體與微柱中相應人免疫球蛋白抗體和/或抗補體抗體形成的特異性紅細胞免疫復合物位于凝膠表面或膠中，呈現陽性反應，一般根據反應強度從4+～1+依次減弱，還可能出現溶血、混合視野雙群等非典型凝集狀態。產品應提供不同凝集強度的圖例或相片，提供生產企業對不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應包含溶血、混合視野雙群等情況。

應注意如產品有多個預期用途如不規則抗體篩查、交叉配血等，針對每種預期用途都應分別進行陽性判斷值的建立與驗證。

5.產品說明書

說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一，也是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據。說明書中產品預期用途、檢驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息是產品研發、性能評估和臨床試驗的總結，應與申報資料中的相關研究結果保持一致。配合使用的離心機、紅細胞配制用LISS液、抗體篩查用紅細胞等，是研究結果穩定重現的重要保證，應在說明書中明確生產廠家、規格/型號、貨號等重要信息。根據性能評估、陽性判斷值及臨床試驗驗證的全面與否，嚴謹確定產品的預期用途，如不規則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細胞的檢測（明確疾病類型）等，并明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗[9,10]。

6.小結

抗人球蛋白檢測是檢測不規則抗體的常用方法，也是診斷免疫性溶血病的重要指標，在臨床輸血前檢測中具有重要意義。近年來，以微柱凝膠法為代表的抗人球蛋白檢測試劑在臨床中取得了廣泛應用。該類產品雖然技術原理及操作相對簡單，但風險較高，在生產研發中應進行嚴格的質量控制，如在抗體、凝膠及緩沖液篩選中應合理制定質量標準，產品生產過程中對于抗體濃度的選擇、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過程等關鍵工藝進行確認[11]。希望通過本文對抗人球蛋白檢測試劑申報過程中常見問題的梳理，幫助申請人減少注冊申報資料中的問題，提升該類產品注冊申報資料質量。