耐酸砷還原菌Bacillus sp.strain P3-23的分離鑒定及其對高砷土壤砷釋放影響

劉紫薇，祝賢彬，馮紀龍，石晚霞

(1.中國地質大學(武漢)環境學院，湖北 武漢 430078；2.長江大學資源與環境學院，湖北 武漢 430100)

砷(As)是一種有毒元素，廣泛存在于自然環境中，天然活動和人為活動都會導致砷向危害人類健康與正常生活的方向歸趨。土壤砷污染、水體砷污染和大氣砷污染等嚴重環境安全問題已引起世界各國的關注。土壤中的砷可通過粉塵或者煙霧進入到大氣中，并可通過地表徑流或滲漏作用進入水體中。砷污染水體體系中，砷污染地下水對人類的影響直接且顯著，直接飲用地下水或使用高砷地下水灌溉農田導致人類砷中毒的現象已屢見不鮮。

砷污染地下水分布于世界各地，情況尤為嚴重的國家和地區有阿根廷、孟加拉、智利、中國大陸地區、中國臺灣地區、印度孟加拉州、墨西哥中部、羅馬尼亞和越南等，地下水砷污染已成為人類共同面臨的嚴重環境污染問題。含砷鐵(氫)氧化物礦物的還原性溶解被認為是原生高砷地下水形成的主要機制，一方面鐵還原菌還原三價鐵的同時使礦物溶解，釋放出吸附于礦物表面的砷；另一方面在砷還原微生物作用下，吸附性更高的As被還原為遷移性更強的As，導致砷在水體中遷移與富集，微生物在此過程中起關鍵作用。因此，全面認識砷污染地下水的形成機制對砷污染地下水的時空分布預測與精準治理是至關重要的，故集中研究砷循環相關微生物是必要的，其作用規律對揭示砷的遷移與轉化規律有重要意義，可為砷污染的發展趨勢預測與防治提供科學依據。

砷還原菌是砷生物地球化學循環中最主要的微生物之一。許多學者分離出砷還原菌單菌，實驗證明其可以直接參與吸附態砷的溶解與釋放，在砷污染地下水形成過程中對砷的遷移與轉化起關鍵作用。砷還原微生物的功能特性如今研究得較為透徹，不少研究關注到環境因素對于砷還原微生物作用的影響。Blum等分離出一株耐高鹽砷還原菌，表明砷還原菌可存在于極端環境中，對環境有極強的適應能力，也預示著地球以外生境微生物存在的可能性。

本實驗從石門雄黃尾礦高砷土壤中分離得到一株耐酸砷還原菌，通過分子生物學和微生物學手段對其進行系統分類和生理生化特性鑒定，并使用微生物學方法在不同溫度、pH值和電子供體條件下進行培養，探究其對環境因素波動的適應能力，檢測菌株對高砷土壤砷釋放作用的影響。該實驗結果對人們認識砷還原微生物生物學特征和生理習性有幫助，極端環境中也可預測其存在的可能性，這將有助于更加深入探索砷污染地下水的形成機制，同時完善砷的生物地球化學循環模式。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集與檢測

砷污染土壤樣品采自于湖南省常德市石門縣雄黃礦區(北緯29.7°，東經111.0°)，采集大約地面下5～6 cm處土壤，并置于事先滅菌的50.0 mL離心管中，快速運回實驗室，于冰箱中4℃保存。

土壤樣品用王水煮沸消解2 h后取上清液使用原子熒光光譜儀檢測總砷含量。取新鮮土壤樣品平鋪于干凈的稱量紙上，放置于陰涼通風處風干，研磨后過2 mm篩，并稱取處理后樣品2 g，放入10 mL離心管中，加入5 mL已除去二氧化碳的水，振蕩器劇烈振蕩5 min，靜置3 h后，采用pH計檢測浸出液pH值。

1. 2 菌株分離和純化

配制MM培養基分裝至25 mL厭氧管中，每管10 mL，氮吹儀鼓氬氣除氧10 min后高溫蒸汽(121℃，0.1 MPa)滅菌20 min，備用。在厭氧手套箱中稱取0.2 g沉積物樣品，放入培養基中，加入2.0 mM丙酮酸鈉作為碳源/電子供體，2.0 mM As作為電子受體,置于培養箱中30℃厭氧培養一周。待As完全還原后將富集液按體積比1∶10轉接至新培養基中，如此轉接3輪，得到生長繁殖穩定的砷還原菌富集液。用Huntage厭氧滾管法分離砷還原單菌，厭氧管配制MM固體培養基，取富集液100.0 μL逐級稀釋10、10、10、10后，各濃度梯度取300.0 μL注入未凝固的固體培養基中，迅速橫向置于冰上滾動至培養基凝固，置于培養箱中30℃培養3 d。待管壁長出乳白色單菌落，使用一次性滅菌接種針挑取菌落至液體培養基擴大培養。為了得到單菌，取培養后的菌液重復上述滾管操作純化2次。

1.3 菌株Bacillus sp.strain P3-23鑒定

取1.0 mL菌液用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，測量DNA濃度。使用16S rDNA擴增引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′擴增16S rRNA基因，PCR程序設為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火65℃ 45 s，延伸72℃ 1 min(以上變性、退火、延伸共35個循環)，延伸72℃ 10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 500 bp左右有亮帶的PCR產物送至武漢天一輝遠生物技術有限公司進行測序。測序后序列在NCBI中進行BLAST分析后，使用鄰接法構建系統發育樹。

菌液涂布于MM固體培養基，有氧培養2 d長出單菌落，觀察單菌落形態特征。菌株P3-23經革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.4 菌株Bacillus sp.strain P3-23的生長、功能特性及耐砷檢測

擴大培養純化后的菌株P3-23，以4℃、6 500 r/min離心10 min收集菌體。為了檢測菌株對不同有機電子供體/碳源利用情況，將菌體分別接種至含乳酸鈉、乙酸鈉、甲酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甲醇、乙醇、丙三醇以及酵母提取物(酵母味素)的無菌MM培養基中，濃度均為2.0 mM。為了檢測菌株在不同溫度下的生長狀況，將菌體接種至含2.0 mM丙酮酸鈉的滅菌MM培養基中，分別置于4℃、22℃、30℃、37℃、45℃、60℃厭氧培養。調節MM液體培養基pH值分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.4、8.4，30℃以上每個變量設置3個平行實驗組，30℃厭氧培養72 h后收集樣品檢測細菌的生長程度以及As還原率。以上試驗使用同一批擴大培養的菌體同時進行厭氧培養，且保持取樣時間同步。

為了檢測菌株P3-23的耐砷特性，將菌株接種至砷濃度分別為0.0 mM、1.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、30.0 mM和40.0 mM的MM培養基中有氧振蕩培養20 h，間隔2 h取樣一次測量

OD

。為了檢測菌株P3-23砷還原特性，設置以下試驗：培養基中加入2.0 mM丙酮酸鈉和2.0 mM砷酸鈉，3組試驗組加入等量等濃度的菌液，設置空白對照一組，加入與試驗組菌液等體積的無菌培養基。置于培養箱中30℃厭氧培養3 d，間隔一定時間取樣一次，取樣完畢測試菌懸液光密度值和As濃度。

1.5 菌株Bacillus sp. strain P3-23對含砷沉積物的影響

為了檢測菌株P3-23對含砷沉積物的影響，設置以下試驗：①滅活沉積物+丙酮酸鈉；②滅活沉積物+丙酮酸鈉+菌株P3-23。試驗設置3組重復。

配置人工合成地下水培養基，稱取0.2 g采集的石門沉積物樣品，放入50 mL厭氧瓶中，裝入20 mL人工合成地下水培養基后氮吹儀鼓入高純度氬氣(>99.9%)除氧20 min，塞緊橡膠塞，鋁蓋封口，高溫高壓滅菌備用。在紫外線照射30 min滅菌后的厭氧手套箱中將收集的純化后菌體接種至上述培養基中。所有試驗都設置3組平行試驗，放置于振蕩培養箱，30℃、120 r/min避光培養。從接種時間開始，每間隔一定時間取樣一次，檢測溶液中可溶性總砷含量及As濃度。

2 結果與分析

2. 1 土壤樣品中含砷量檢測

土壤砷含量一般為5.0～15.0 mg/kg。石門土壤樣品中總砷含量為1 259.38 mg/kg，可溶砷含量為295.99 mg/kg，結果表明：石門采樣地土壤砷污染異常嚴重，高濃度的可溶性砷含量表明砷還原微生物的存在。土壤pH值為5.74，偏酸性，微生物存在于此環境中進化出耐酸能力。

2.2 單株Bacillu sp. strain P3-23的分離與鑒定

厭氧管滾管挑取單菌落到液體培養基厭氧培養，取菌液提取細菌DNA，使用Thermo Nanodrop one檢測其濃度為26.94 ng/μL。擴增16S rRNA基因，測序后序列在NCBI中進行BLAST分析,結果顯示其與菌株

Bacillu

niaini

strain Et9/1同源性最高，序列相似性為98.7%，與芽孢桿菌屬菌株DRG4、NBPP3、SJC-04、IDA115和IDA3307的相似性分別為97.40%、97.40%、97.39%、97.34%和97.0%。因此，P3-23為芽孢桿菌屬(

Bacillus

)成員，故命名為

Bacillu

sp. strain P3-23(以下簡稱P3-23)，基因文庫中編號為MT912948。與其同屬的E1H是一株已被報道的呼吸性砷還原菌。菌株

Bacillus

sp. strain P3-23 16S rDNA系統發育樹分析見圖1。 菌株P3-23形態特性顯示：在MM固體平板上呈圓形，中間微隆起，黏稠光滑，菌落中間為乳白色，沿周邊逐漸呈現透明狀。革蘭氏染色結果呈藍紫色，表明其為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株Bacillus sp. strain P3-23 16S rDNA系統發育進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree constructed from the multiple sequence alignment of the 16S rRNA gene of strain Bacillus sp.P3-23 and its closely related species

2.3 不同條件下菌株Bacillu sp. strain P3-23的生長狀況檢測

不同溫度條件下厭氧培養3 d后菌株P3-23的生長狀況和砷還原率檢測結果，見圖2。

圖2 不同溫度條件下菌株P3-23的生長狀況和砷 還原率Fig.2 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different temperatures

由圖2可見，4℃、45℃和60℃條件下，菌株不生長；22℃、30℃和37℃條件下生長良好，30℃為菌株P3-23最適宜的生長溫度；4℃、22℃、30℃、37℃、45℃、60℃條件下對應的As(Ⅴ)還原率分別為3.2%、63.8%、98.6%、92.7%、5.6%、2.6%，可見30℃條件下菌株P3-23還原As(Ⅴ)的能力最強。

不同碳源/電子供體條件下菌株P3-23的生長狀況和砷還原率檢測結果，見圖3。

圖3 不同碳源/電子供體條件下菌株P3-23的生長狀況 和砷還原率Fig.3 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different kinds of electron donor

由圖3可見，菌株P3-23不能利用乙酸鈉、甲酸鈉、甲醇和乙醇作為電子供體；利用酵母味素、丙三醇、檸檬酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、蔗糖和丙酮酸的情況下，As(Ⅴ)還原率分別為38.4%、78.3%、86.6%、91.7%、92.1%、92.9%和94.7%；丙酮酸鈉是菌株P3-23進行砷還原作用最適宜的電子供體，蔗糖為其生長繁殖最適宜的碳源；菌株P3-23在利用酵母味素過程中，As(Ⅴ)還原率僅為38.4%，但菌株生長狀況良好，

OD

值顯著高于其他有機電子供體，說明菌株P3-23在營養豐富能滿足自身生長繁殖的情況下，不會持續進行砷還原作用；菌株P3-23可利用葡萄糖和蔗糖進行糖酵解作用，可溶性小分子有機酸化合物檸檬酸鈉、乳酸鈉和丙酮酸鈉也能被P3-23充分利用，其中丙酮酸作為糖酵降解過程的最終產物，是P3-23進行砷還原作用最適宜的碳源/電子供體。因乙醇和甲醇對生物具有毒害作用，3種醇類物質中P3-23只能利用丙三醇。

在不同pH值條件下，菌株P3-23的生長情況和砷還原率見圖4。

圖4 不同pH值條件下菌株P3-23的生長狀況及砷還原率Fig.4 Growth and arsenate reduction curve of strain P3-23 in the presence of different pH values

由圖4可見，菌株P3-23在pH值小于3.5和大于7.5的條件下不能生長,在pH值為3.5、4.5、5.6、6.5、7.5的條件下均可還原As(Ⅴ)，但在堿性條件下P3-23無法生存，說明P3-23是一株耐酸菌，在pH值為3.5條件下不僅能生長，而且能正常進行砷還原作用。湖南石門雄黃礦區土壤逐漸酸化，P3-23在酸性環境中進化出耐酸機制，對環境適應能力強。

2.4 菌株Bacillus sp. strain P3-23砷還原和砷耐性檢測

菌株P3-23的砷還原檢測結果，見圖5。

圖5 菌株P3-23的砷還原曲線Fig.5 Arsenate reduction curves of strain P3-23

由圖5可見，菌株P3-23在72 h內能完全還原2.0 mM As(Ⅴ)，菌液濃度隨著砷還原率的增加而增長。

不同砷濃度條件下菌株P3-23的生長曲線見圖6。

圖6 不同砷濃度下菌株P3-23的生長曲線Fig.6 Growth curves of strain P3-23 in the presence of different As concentration

由圖6可見，菌株P3-23在0.0 mM、1.0 mM、10.0 mM、20.0 mM、30.0 mM和40.0 mM的砷濃度下均能生長，最適宜生長的砷濃度為1.0 mM，當砷濃度達到40.0 mM時菌株的生長受到明顯的抑制但仍能生存。菌株P3-23具有強耐砷能力，且在適宜的砷濃度條件下生長狀況更良好，這說明該菌株長期生存于砷污染土壤中,一定濃度砷存在的環境，更適合P3-23生長繁殖。

2.5 菌株Bacillu sp. strain P3-23對高砷土壤砷釋放的影響

菌株P3-23對石門高砷土壤砷釋放的影響見圖7。

圖7 菌株P3-23對石門高砷土壤砷釋放的影響Fig.7 Effect of strain P3-23 on the release of arsenic from the high-arsenic soil of Shimen

由圖7可知，菌株P3-23對石門高砷土壤可溶性砷釋放有明顯的促進作用，分別在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、9 d、11 d檢測到可溶性砷濃度分別為6.9 μM、17.5 μM、50.3 μM、61.0 μM、114.1 μM、166.5 μM和201.9 μM，檢測砷形態分析表明As占比達83.3%以上，未接種P3-23滅活土壤中只能檢測到微量可溶性砷。可見，菌株P3-23能顯著促進石門高砷土壤中砷的釋放過程，這是由于土壤中吸附態As(Ⅴ)在其砷還原作用下轉化為遷移性更強的As(Ⅲ),土壤砷在淹水條件下釋放并在水體中積累，通過地表徑流及滲透作用污染地表水及地下水，增加人體暴露于高濃度砷的可能性。

3 結論與展望

本實驗從石門高砷土壤中分離出一株耐酸性砷還原菌，根據其16S rRNA基因序列分析初步確定其屬于芽孢桿菌屬，故命名為

Bacillu

sp. strain P3-23(簡稱P3-23)。生物學試驗和砷形態分析結果表明：菌株P3-23砷還原功能強，最適宜的碳源為丙酮酸鈉，可在72 h內將2.0 mM As(Ⅴ)完全還原。菌株P3-23具有較強的砷抗性，40.0 mM砷存在的條件下仍可生長，其同時具有很強的耐酸性，pH值低至3.5的條件下仍可正常進行砷還原作用。高砷土壤砷釋放試驗中菌株P3-23能明顯增加土壤中可溶性砷含量，表明砷還原微生物是吸附態、結合態砷釋放的主要驅動力量，一方面可作為土壤砷修復過程中砷生物浸出方法的研究材料，另一方面是造成水體砷污染的關鍵因素。因此，研究砷還原微生物對砷污染成因及其修復機制具有重要意義。耐酸性砷還原菌的分離鑒定表明：砷還原菌生存范圍廣，預示著其可能存在于各種極端環境中，關注極端環境中砷還原微生物的作用，對完善砷的生物地球化學循環模式具有重要的意義。