胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷兔子模型對心肌細胞增殖、血流動力、心肌成纖維增生及心功能的變化

馮衛中 徐鵬 張金堂

[摘要] 目的 探討胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷兔子模型心肌細胞增殖、血流動力、心肌成纖維增生及心功能的變化。 方法 隨機選取清潔級健康成年新西蘭大白兔60只，將兔子隨機分為假手術組及模型組兩組，每組兔子30只。假手術組開胸后不結扎胸主動脈，模型組開胸后分離胸主動脈。分別測定各組兔子血流動力學和心功能指標水平、心重指數和心肌細胞體積水平、心肌細胞增殖情況、心肌組織形態變化以及各組心肌膠原含量以及各組血清腦鈉肽（BNP）、氨基端前腦鈉肽（NT-proBNP）水平。 結果 與假手術組對比，模型組兔子LVSP、LVDP、動脈收縮壓及動脈舒張壓、BNP、NT-proBNP水平、心重指數、細胞增殖指數均明顯升高，心肌細胞體積、CVF-V、CVF-NV含量均明顯增加，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均明顯減低（P<0.05或P<0.01）。假手術組心肌細胞排列正常，細胞核呈橢圓形，心肌間質無明顯增生，心肌纖維走形整齊、結構清晰;模型組部分心肌細胞周圍結構不清，細胞核固縮，心肌纖維排列紊亂，纖維增生肥大、斷裂。 結論 胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷兔子模型能夠抑制心肌細胞增殖、促進心肌成纖維增生，對兔子血流動力及心功能均產生了嚴重影響。

[關鍵詞] 胸主動脈縮窄術;壓力超負荷;心肌細胞增殖;血流動力;心肌成纖維增生;心功能

[Abstract] Objective To investigate the changes of myocardial cell proliferation， hemodynamics， myocardial fibroblast hyperplasia and cardiac function in rabbits with pressure overload replicated by thoracic aortic coarctation. Methods A total of 60 clean healthy adult New Zealand rabbits were randomly selected and divided into two groups： the sham operation group（n=30） and the model group（n=30）. The sham operation group was not ligated the thoracic aorta after thoracotomy， while the model group was separated the thoracic aorta after thoracotomy. Hemodynamics and cardiac function index level， cardiac weight index and myocardial cell volume level， myocardial cell proliferation， myocardial tissue morphological changes， myocardial collagen content， serum brain natriuretic peptide（BNP） and amino-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP） levels in each group were measured respectively. Results Compared with the sham operation group， LVSP， LVDP， arterial systolic pressure and diastolic pressure， BNP， NT-proBNP level， cardiac weight index and cell proliferation index in the model group significantly raised. The myocardial cell volume， CVF-V， CVF-NV content were significantly increased， and +dp/dtmax and -dp/dtmax levels were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. In the sham operation group， myocardial cells were arranged normally， nucleus was oval， myocardial interstitium did not proliferate obviously， and myocardial fibers had regular shape and clear structure. In the model group， the peripheral structure of some myocardial cells was unclear， nucleus shrinked， myocardial fibers were disordered， and fibers proliferated， hypertrophied and fractured. Conclusion The pressure overload rabbit model reproduced by thoracic aortic coarctation can inhibit myocardial cell proliferation and promote myocardial fibroblast hyperplasia， which has a serious impact on rabbits′ hemodynamics and cardiac function.

[Key words] Thoracic aortic coarctation; Pressure overload; Myocardial cell proliferation; Hemodynamics; Myocardial fibroblast hyperplasia; Cardiac function

心肌肥厚是心肌對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死等多種原因造成的壓力或容量超負荷的一種基本應答，主要表現為心肌細胞體積增大、心肌間質組織增生等，使心臟的順應性及循環泵功能明顯降低[1]。研究發現，心肌肥厚與多種心血管疾病的發展過程密切相關，其在代償初期往往能夠維持正常的室壁張力，但長期的心肌肥厚會明顯增加心衰和猝死的發生率，心肌肥厚可作為心肌缺血、心律失常以及猝死等的獨立危險因素[2]。心肌肥厚是一個復雜的病理過程，其發生機制尚不明確，認為主要與心肌負荷過重、心肌壞死纖維化、心肌細胞凋亡、神經內分泌、基因改變以及環境等因素有關[3]。據報道，在心肌肥厚的啟動機制方面，壓力或容量超負荷對心肌細胞膜產生的牽張作用被室壁的機械感受器所感受，經細胞骨架或牽張激活的離子通路轉入胞內;此外，壓力或容量超負荷還會使細胞因子、生長因子等神經體液因素的釋放明顯增多[4-5]。目前，心臟瓣膜置換術是治療瓣膜疾病的主要方式，但其對于部分以主動脈瓣狹窄為主的心臟疾病術后心臟舒張功能的恢復效果不佳，其中，主動脈瓣狹窄為主聯合瓣膜病患者心肌纖維化程度尤其嚴重[6]。因此本組研究主要采用胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷左心肥厚兔子模型，旨在探討其對心肌細胞增殖、血流動力、心肌成纖維增生及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

隨機選取清潔級健康成年新西蘭大白兔60只[江蘇振林生物科技有限公司，SCXK（蘇）2019-0002]，月齡4個月，體重（1960.17±132.32）g，在實驗室溫度（24±3）℃、濕度（45±5）%、晝夜時間各12 h的環境中適應性飼養1周。

1.2 實驗器材及試劑

超低溫冰箱（北京艾澤信科技有限公司，型號：DW-86L288）;電子天平（上海友縝電子科技有限公司，型號：BSM）;電子顯微鏡（濟寧市鑫兗礦山機械設備有限公司，型號：SZ-139）;電熱恒溫水箱（蘇州凱特爾儀器設備有限公司，型號：K-WHS）;石蠟切片機（北京盛科信德科技有限公司，型號：RM2235）;低溫高速離心機（山東博科科學儀器有限公司，型號：TG-16M）;超凈工作臺（山東博科科學儀器有限公司，型號：BBS-H1100）;多普勒超聲測定儀（北京中西遠大科技有限公司，型號：LSH10-1）;全自動生化分析儀（美國美國貝克曼庫爾特公司，型號：AU5800）;戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司，規格：1 mg/mL）;二甲苯（張家港澤潤欣化工有限公司）;蘇木素-伊紅染液（HE）（上海信帆生物科技有限公司）。

1.3建立實驗動物模型

將兔子隨機分為假手術組及模型組兩組，每組兔子30只。

建立動物模型：將兔子禁食4 h后經耳緣靜脈注射30 mg/mL 3%戊巴比妥鈉進行麻醉，當兔子后肢腳蹬反射消失后，取仰臥位，將其固定于工作臺上。剔除頸部毛發，剪開頸部皮膚進行氣管插管。將兔子胸部毛發剔除，消毒，沿胸骨中線偏左剪開皮膚并逐層分離肌肉，打開胸腔（過程中避開肋間動脈），取開胸器固定，暴露升主動脈，分離主動脈弓周圍血管及結締組織。定位分離胸主動脈，使用無菌聚乙烯塑料管墊扎約50%，排除胸腔空氣，逐層縫合肌肉及皮膚。當兔子恢復自主呼吸后，拔出氣管插管。術后正常飲食，連續3 d注射青霉素防止感染。假手術組開胸后不結扎胸主動脈，其余步驟同模型組相同。

1.4 實驗方法

心功能：每組取5只兔子，采用多普勒超聲測定儀測定各組左心室舒張壓（Left ventricular diastolic pressure，LVDP）、左心室收縮壓（Left ventricular systolic pressure ，LVSP）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax）及左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）變化。

血流動力學：采用多普勒超聲測定儀測定各組兔子動脈收縮壓、動脈舒張壓、心率等的變化。

每組取5只兔子，取出心臟，去除血管、脂肪等多余組織，吸干水分后稱重，計算各組兔子心重指數。心重指數=心臟重量/體重。將心臟切碎，離心，在顯微鏡下觀察心肌細胞的長度、厚度及寬度，計算各組心肌細胞體積變化。心肌細胞體積=[π×（寬度÷2）×（厚度÷2）]×1。

采用免疫組化法測定兩組兔子增殖細胞抗原（Proliferating cell antigen，PCNA）表達水平。每組取5只兔子，取出心臟，將其放入福爾馬林溶液中進行固定，常規制作石蠟切片，將組織切片在60℃烤箱中烤約30 min，使用二甲苯脫蠟、酒精脫水，加入0.01 mol/L檸檬酸鈉進行抗原修復，室溫下靜置30 min，5%羊血清封閉，去除血清加一抗在4℃條件下孵育過夜，加入二抗，使用磷酸鹽緩沖液沖洗，免疫組化染色、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。在顯微鏡下進行觀察。取細胞分布均勻的5個視野，每個視野下約200細胞，觀察、記錄各組陽性細胞數，并計算細胞增殖指數。

采用HE染色法觀察各組心肌組織形態變化。每組取5只兔子，取其心臟，常規制作石蠟切片，放入60℃左右烤箱中烤干，使用二甲苯脫蠟、酒精脫水，蘇木素染色約5 min，流水沖洗，蒸餾水浸泡10 min，伊紅染色3 min，脫水、透明、樹膠封片。使用顯微鏡進行觀察記錄。

每組取5只兔子，采用組織光度法測定各組心肌膠原含量，心肌膠原含量采用膠原容積分數（Collagen volume fraction，CVF）表示，包括CVF-V、CVF-NV。

將剩余5只兔子取腹主動脈血5 mL，靜置離心，取上清液，采用全自動生化分析儀測定各組血清腦鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）、氨基端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）水平。

1.5觀察指標

測定各組兔子心功能（LVDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax）水平、血流動力學（動脈收縮壓、動脈舒張壓、心率）水平、心重指數、心肌細胞體積、PCNA表達水平、細胞增殖指數、心肌組織形態變化、心肌膠原含量（CVF-V、CVF-NV）以及血清BNP、NT-proBNP水平變化。采用免疫組化法測定兩組兔子心肌細胞增殖情況。采用多普勒超聲測定儀測定各組兔子血流動力學及心功能指標水平。采用HE染色法觀察各組心肌組織形態變化。采用組織光度法測定各組心肌膠原含量。采用全自動生化分析儀測定各組血清BNP、NT-proBNP變化。

1.6 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件進行數據分析，本組研究中計數資料以[n（%）]表示，比較均采用χ2檢驗。計量資料以（x±s）表示，比較均采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組兔子心功能指標比較

與假手術組對比，模型組兔子LVSP、LVDP水平均明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均明顯減低（P<0.01或P<0.05）。見表1。

2.2 各組兔子血流動力學比較

與假手術組對比，模型組兔子動脈收縮壓及動脈舒張壓均明顯升高（P<0.01），兩組心率比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組兔子心重指數及心肌細胞體積比較

與假手術組對比，模型組心重指數及心肌細胞體積均明顯增加（P<0.01）。見表3。

2.4 各組兔子心肌細胞增殖情況比較

細胞陽性主要表達于細胞核中，染色呈棕黃色。模型組細胞增殖指數明顯高于假手術組（P<0.01）。見表4。

2.5 各組兔子心肌組織形態變化

假手術組：心肌細胞呈桿狀，心肌細胞排列正常，細胞核呈橢圓形，心肌間質無明顯增生，心肌纖維走形整齊、結構清晰，無擴張及血管壁增厚。模型組：心肌細胞變形、部分心肌細胞周圍結構不清，心肌細胞核固縮，心肌纖維排列紊亂，間隙增寬，纖維增生肥大、斷裂。見封三圖4。

2.6各組CVF-V、CVF-NV水平比較

與假手術組比較，模型組心肌CVF-V、CVF-NV含量明顯增高（P<0.01）。見表5。

2.7各組血清BNP、NT-proBNP水平比較

與假手術組對比，模型組兔子血清BNP、NT-proBNP水平均明顯升高（P<0.01）。見表6。

3 討論

心肌肥厚是常見于壓力負荷長期增加的疾病，如高血壓、主動脈狹窄等，它是心臟的一種代償性反應，主要表現為心肌細胞增大、間質細胞增生、間質膠原沉積以及心臟重量增加等[7]。心肌肥厚發生的機制是心臟對長期增加的壓力負荷產生的適應性反應導致，在負荷過重的刺激下，通過增加肌肉組織的體積，以適應工作負荷的增加[8]。據相關報道，心臟結構性適應不只是有量的增加，還伴有質的變化;不只是心肌細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞以及膠原纖維等也發生了明顯的改變[9-10]。本研究主要采用胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷兔子模型，并對其心肌細胞增殖、血流動力、心肌成纖維增生及心功能產生的影響進行分析。

心臟是人和脊椎動物身體血液循環的中樞，也是生命得以維持的基礎。它負責提供將血液推進身體各個部分的動力，給身體的組織器官提供充足的血流量，使細胞能夠維持正常的代謝及功能[11]。本研究中建立動物模型后，通過超聲心電圖對心臟進行連續的、反復的觀察及血流動力學監測，結果發現，模型組動脈收縮壓、動脈舒張壓、LVSP、LVDP等均明顯高于假手術組，+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于假手術組（P<0.05），提示胸主動脈縮窄會對血流動力及心功能產生明顯影響，LVDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等是反映心功能的重要指標。

反映心肌細胞增殖的指標有很多，PCNA又稱細胞周期素或DNA聚合酶輔助因子，是主要存在于細胞核中的一種酸性蛋白，它可以作為DNA聚合酶的輔助因子與作為DNA修復相關的輔助因子，在DNA復制和細胞周期過程中起著重要的調控作用，在啟動細胞增殖中扮演著重要角色[12-13]。有研究發現，長期的壓力負荷除了能夠引起心臟、血管結構功能的改變，還可以引起心肌成纖維化增生[14]。心肌成纖維化增生會導致心肌順應性降低，心肌細胞供氧減少，膠原纖維明顯增加;過量增生的膠原纖維會將心肌細胞緊密包圍，心肌舒張及收縮功能進一步受損[15-16]。Hui-Hua等[17]研究表明，膠原纖維在維持心臟正常功能方面起著與心肌細胞同等重要的作用，對心肌細胞起支持、排列等作用，是心肌硬度的決定因素。本研究結果發現，胸主動脈縮窄能夠使心肌肥厚、心肌細胞體積增大、心肌成纖維增生，對心肌細胞增殖具有明顯的抑制作用。

有研究發現，神經內分泌系統過度激活造成的系統反應與心肌肥厚的發生、發展密切相關[18]。BNP、NT-proBNP均為神經內分泌激素，主要由心肌細胞合成，其分泌受神經內分泌系統及血流動力學的調控。當心室功能不全時，BNP、NT-proBNP水平明顯升高。BNP、NT-proBNP是反映心力衰竭及其預后的重要預測性指標[19-20]。本研究結果中，模型組BNP、NT-pro BNP水平明顯高于假手術組（P<0.05），提示胸主動脈縮窄能夠明顯使心臟神經內分泌過度激活，促進心肌肥厚的發生，與相關文獻[15]研究結果一致。

綜上所述，胸主動脈縮窄術復制壓力超負荷兔子模型，能夠使心肌細胞明顯增大、抑制心肌細胞增殖、促進心肌成纖維增生，對兔子血流動力及心功能均產生了嚴重影響。

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（收稿日期：2020-04-17）