木犀草素對K562細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制

彭艷輝，段智，李濤△

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）發(fā)源于造血干細(xì)胞，是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤［1］。CML的主要特點在于特征性斷點簇區(qū)域?c?abl癌 基 因1（breakpoint cluster region?c?abl oncogene 1，BCR?ABL）融合基因的形成，約90%的CML患者存在9號和22號染色體易位形成的BCR?ABL融合基因［1?2］。其表達(dá)的BCR?ABL融合蛋白作為一種酪氨酸激酶持續(xù)性激活下游增殖、分化等相關(guān)信號通路，從而導(dǎo)致疾病的惡化［2］。針對CML的治療主要應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI），然而TKI對部分患者的治療效果不明顯［1］，進(jìn)一步探索治療CML的藥物具有非常重要的臨床意義。木犀草素（luteolin）為黃酮類化合物，是一種來源于植物的生物活性成分，具有抗氧化［3］、抗炎［4］、抗過敏［5］等多種生物學(xué)作用。作為傳統(tǒng)的中草藥成分之一，木犀草素在膀胱癌［6］、乳腺癌［7］、結(jié)腸癌［8］等癌癥中均顯示出抗腫瘤功效。然而，有關(guān)木犀草素在白血病中作用的研究尚少見。本研究旨在探討木犀草素對CML K562細(xì)胞的作用及其潛在機(jī)制，為白血病藥物篩選提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器木犀草素、Annexin V?PE/7ADD凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青?鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）、CCK?8增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）、Bcl?2相關(guān)X蛋白（Bcl?2?associated X protein，Bax）、多 聚ADP核 糖 聚 合 酶（Poly ADP?ribose polymerase，PARP）、裂解的多聚ADP核糖聚合酶（Cleaved?poly ADP?ribose polymerase，Cleaved?PARP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved?Caspase3）、蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated?protein kinase B，p?AKT）、斷 裂點 簇 區(qū) 蛋 白（Breakpoint cluster region，BCR）、c?abl癌基因1（c?ABL）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗β?肌動蛋白（β?actin）抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；對應(yīng)的羊抗兔、羊抗鼠酶標(biāo)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱（311型）、多功能酶標(biāo)儀（JS?THERMO Varioskan Flash）、蛋白電泳儀（EI0001）購自美國Thermo Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem Q）購自美國ProteinSimple公司；流式細(xì)胞分析儀（MoFlo XDP）購自美國Beckman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)CML K562細(xì)胞購自南京科佰生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10%FBS、1%青?鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至融合度80%～90%時進(jìn)行傳代。選取生長良好且處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 CCK?8法測定細(xì)胞增殖情況取對數(shù)生長期K562細(xì)胞鋪板于96孔板中，細(xì)胞密度為2×105個/孔。實驗設(shè)木犀草素0、10、25、50、100μmol/L組，將木犀草素溶于DMSO配制為1 000μmol/L溶液，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時培養(yǎng)基的量分別加入不同量的木犀草素溶液使培養(yǎng)基木犀草素終濃度分別為10、25、50、100μmol/L，0μmol/L組僅加入DMSO，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔。分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10μL CCK?8溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，以酶標(biāo)儀450 nm處測定細(xì)胞吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對照孔A450?實驗孔A450）/對照孔A450×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期K562細(xì)胞加入6孔板中，細(xì)胞密度為1×106個/mL。實驗設(shè)木犀草素0、25、50μmol/L組，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加PBS 350×g離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清。用Binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液體積至1 mL，取100 μL重懸液分別加入5μL 7AAD和5μL Annexin V熒光染料，孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot檢 測Bax、Bcl?2、PARP、Cleaved?PARP、Caspase3、Cleaved?Caspase3、AKT、p?AKT、BCR、c?ABL、BCR?ABL蛋白的表達(dá)將K562細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期，細(xì)胞密度80%時，在不同培養(yǎng)皿中加入木犀草素，調(diào)整終濃度分別為0、10、50、100μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后350×g離心5 min，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解收集細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。分別取不同濃度木犀草素處理后的蛋白80μg，行SDS?PAGE電泳2～2.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，5%TBST配制的脫脂牛奶封閉1 h，孵 育 一 抗Bax（1∶1 000）、Bcl?2（1∶1 000）、PARP（1∶1 000）、Cleaved?PARP（1∶500）、Caspase3（1∶1 000）、Cleaved?Caspase3（1∶500）、AKT（1∶1 000）、p?AKT（1∶1 000）、BCR（1∶1 000）、c?ABL（1∶1 000）、β?actin（1∶5 000）抗體，4℃孵育過夜，隨后回收一抗并以TBST洗滌膜3次，每次5 min，室溫?fù)u床孵育對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）2 h，回收二抗，再次洗滌膜3次，每次5 min，最后加上適量的ECL超敏顯色液化學(xué)發(fā)光顯影。以β?actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值，相對表達(dá)量=目標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗。不同時點多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素抑制K562細(xì)胞增殖CCK?8檢測結(jié)果顯示，隨木犀草素濃度增加及作用時間的延長，K562細(xì)胞增殖抑制率均呈增長趨勢（P＜0.05），見表1。

2.2 木犀草素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，木犀草素0、25、50μmol/L組K562細(xì)胞的凋亡率分別為8.21%±0.55%、23.43%±1.50%和40.47%±2.97%，細(xì)胞凋亡率依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=206.100，P＜0.05），見圖1。

2.3 木犀草素對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響促凋亡蛋白Bax、Cleaved?PARP、Cleaved?Caspase3表達(dá)水平隨木犀草素濃度的增加而升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。木犀草素0、10、50 μmol/L組PARP蛋白表達(dá)水平依次升高（P＜0.05），100μmol/L組與50μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。木犀草素50μmol/L組Caspase3蛋白表達(dá)水平高于0、10μmol/L組，100μmol/L組明顯低于其余組（P＜0.05）。木犀草素50μmol/L組抗凋亡蛋白Bcl?2表達(dá)水平高于0μmol/L組（P＜0.05），與10μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；100μmol/L組明顯低于其余組（P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.1 Comparison of the effect of luteolin on the proliferation between five K562 cell groups表1 木犀草素處理后各組細(xì)胞增殖抑制率比較（n=3，%，x±s）

Fig.1 The effect of luteolin on the apoptosis of K562 cells圖1 木犀草素對K562細(xì)胞凋亡的影響

Fig.2 The effect of luteolin on apoptosis?related proteins圖2 木犀草素對凋亡相關(guān)蛋白的影響

Tab.2 The expression levels of apoptosis-related proteins in four groups of K562 cells表2 各組K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平（n=3，x±s）

2.4 木犀草素對PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響木犀草素50、100μmol/L組p?AKT蛋白表達(dá)水平低于0、10μmol/L組，100μmol/L組低于50μmol/L組（F=55.170，P＜0.05），見圖3。

2.5 木犀草素對BCR?ABL融合蛋白表達(dá)的影響木犀草素50μmol/L組BCR?ABL融合蛋白表達(dá)水平高于0μmol/L組，100μmol/L組低于0、50μmol/L組（Fc?ABL抗體=1 556.000，F(xiàn)BCR抗體=3 802.000，P＜0.05），見圖4。

Fig.3 The effect of luteolin on the expressions of AKT and p?AKT protein in K562 cells圖3 木犀草素對K562細(xì)胞中AKT、p?AKT蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of luteolin on the expressions of BCR,c?ABL and BCR?ABL protein in K562 cells圖4 木犀草素對K562細(xì)胞BCR、c?ABL以及BCR?ABL蛋白表達(dá)的影響

3 討論

CML是一種克隆性骨髓干細(xì)胞疾病，主要特征為染色體易位產(chǎn)生融合蛋白BCR?ABL，激活一系列細(xì)胞增殖相關(guān)信號，加速細(xì)胞分裂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生［1］。伊馬替尼是目前治療CML的首選藥物，但其對部分CML患者的治療效果欠佳［1，9］，進(jìn)一步尋找CML的治療藥物具有重要的臨床意義。

木犀草素是一種天然黃酮化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用［8,10?11］。本研究結(jié)果顯示，木犀草素可抑制K562細(xì)胞的增殖，且其抑制作用呈劑量及時間依賴性；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，木犀草素可誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。王旭光等［12］研究亦顯示，木犀草素可抑制K562細(xì)胞的增殖，與本研究結(jié)果一致。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要形式。在接收到上游凋亡信號后，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，細(xì)胞質(zhì)起皺，DNA片段化降解，細(xì)胞最終死亡［13］。Bcl?2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要信號蛋白家族之一［14］，Bax蛋白是線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的重要組分。在受到凋亡性刺激后，Bax轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增加膜的通透性導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放，釋放的細(xì)胞色素C進(jìn)一步激活Caspase信號啟動凋亡［15?16］。Bcl?2為抑制凋亡蛋白，能抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而抵抗凋亡性刺激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［15?16］。本研究結(jié)果顯示，木犀草素處理細(xì)胞后促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高，提示木犀草素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase3是凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)因子之一，其對多種關(guān)鍵蛋白有裂解作用，裂解的Caspase3可以剪切PARP并誘導(dǎo)凋亡［17?18］。Caspase3和PARP的裂解在細(xì)胞凋亡中具有重要作用［13］。本研究結(jié)果顯示，促凋亡蛋白Cleaved?Caspase3、Cleaved?PARP表達(dá)水平隨木犀草素濃度的增加而升高，提示木犀草素可能通過激活Caspase級聯(lián)進(jìn)一步誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。與本研究結(jié)果類似，木犀草素在乳腺癌［7，11］、結(jié)直腸癌［8］等多種腫瘤中也可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，以上研究結(jié)果進(jìn)一步證實木犀草素具有抗腫瘤作用。

PI3K/AKT信號通路是常見的信號通路之一，活化的AKT能抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，保持細(xì)胞存活［19］。腫瘤中異常激活的PI3K/AKT信號在細(xì)胞的存活與增殖中發(fā)揮著重要作用［20?22］。Yao等［23］研究報道木犀草素可通過抑制PI3K/AKT信號抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，木犀草素50、100μmol/L組p?AKT蛋白表達(dá)水平低于0、10μmol/L組，100μmol/L組低于50μmol/L組，提示在較高濃度的木犀草素（50、100μmol/L）作用下，K562細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路受到了抑制；但在較低濃度的木犀草素（10μmol/L）并未顯示出對該信號的抑制。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡結(jié)果，筆者推測較高濃度（50μmol/L、100μmol/L）的木犀草素可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制K562細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在較低濃度的木犀草素作用中PI3K/AKT信號很可能尚處于應(yīng)激反應(yīng)的前期，可能有其他的信號參與了細(xì)胞對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控。

考慮到CML存在特異性的BCR?ABL融合蛋白［24］，本研究分析了木犀草素對BCR?ABL融合蛋白的影響。結(jié)果顯示，50μmol/L的木犀草素作用K562細(xì)胞時BCR?ABL融合蛋白表達(dá)有所增加，而100μmol/L的木犀草素顯著抑制了BCR?ABL蛋白的表達(dá)。BCR?ABL融合蛋白可導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖［25］，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡結(jié)果，筆者推測不同濃度的木犀草素可應(yīng)激性地調(diào)控K562細(xì)胞增殖，最終抑制細(xì)胞增殖。PI3K/AKT信號也是能被受體偶聯(lián)的酪氨酸激酶所激活的下游信號之一［26?27］，結(jié)合BCR?ABL的表達(dá)結(jié)果，筆者認(rèn)為高濃度（100 μmol/L）木犀草素可能通過某種途徑降低了BCR?ABL蛋白的表達(dá)，參與負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但在較低濃度的木犀草素作用下，其抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，木犀草素可抑制K562細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控BCR?ABL蛋白表達(dá)及PI3K/AKT信號通路有關(guān)。