孫治霞，索紅亮，李華，李宗尚，施光遠

重癥肺炎是一種發病率和致死率很高的呼吸系統感染病癥，可引起組織器官嚴重缺血、缺氧，造成多器官功能損傷［1］；其中，心肌損傷是常見的肺外并發癥之一，其持續性發展可導致患者心功能障礙和心力衰竭［2］。因此，如何降低重癥肺炎對心肌細胞的損傷備受關注。人參皂苷Rg1是從中藥人參中提取的一種三醇型皂苷，具有抗炎、抗疲勞和抗腫瘤等廣泛的藥理活性［3］。在心肌缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病等疾病中人參皂苷Rg1可通過減輕心肌細胞凋亡和炎癥反應對心肌損傷表現出較好的保護作用［4?5］，但關于人參皂苷Rg1對重癥肺炎心肌損傷的作用研究鮮有報道。肺炎克雷伯菌是一種醫院感染中常見的致病菌，可通過釋放大量脂質體成分的菌膜促進內源性炎癥反應的發生，造成包括心肌組織在內的多種器官損傷，氣管注入其菌液是構建重癥肺炎大鼠模型常用的建模方式［6?7］。本研究通過觀察人參皂苷Rg1對重癥肺炎大鼠心肌組織的影響，旨在揭示其抗炎和抗心肌細胞凋亡是否在抗重癥肺炎心肌損傷中發揮作用，以期為重癥肺炎心肌損傷的防治提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料肺炎克雷伯菌株（貨號：ATCC13883，美國ATCC），清潔級體質量180～220 g SD大鼠［許可證號：SYXK（京）2017?0022，北京維通利華實驗動物技術有限公司］；人參皂苷Rg1（貨號：HG027162，寶雞市辰光生物科技有限公司），B型鈉尿肽（BNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（CK?MB）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：SEKR?0058、SEKR?0048、SEKR?0059，北京索萊寶），活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase?3）、非活化態含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（procaspase?3）、Bcl?2、Bcl?2相關X蛋白（Bax）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子?κB（NF?κB）p65和磷酸化（p）?NF?κB p65以及β?actin抗體（貨號：ab214430、ab32150、ab182858、ab182733、ab13556、ab219413、ab237591、ab239882、ab8226，英國Abcam），實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：RR047A，日本Takara Bio）。全自動數碼凝膠成像分析系統（型號：Tanon 3500，上海天能科技有限公司），動物心功能分析系統（型號：MPA?CFS，上海奧爾科特生物科技有限公司），酶標儀（型號：Multiskan FC，美國賽默飛公司），脈搏血氧儀（型號：YX300，江蘇魚躍醫療設備有限公司），qPCR儀（型號：TL988，西安天隆科技有限公司）。

1.2 重癥肺炎大鼠模型構建和分組處理模型構建［8］：采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，頸部剃毛消毒備皮；無菌條件下，切開頸部皮膚使上端器官暴露出來后，以注射器穿刺氣管的方式注入以0.45%無菌鹽水稀釋制備的肺炎克雷伯菌溶液（1.2×109CFU/mL）0.3 mL，之后將大鼠直立保持30～40 s后進行傷口縫合和消毒。模型構建成功判斷標準［9］：術后大鼠有呼吸急促和行動遲緩現象出現，同時以脈搏血氧儀檢測大鼠后足血氧飽和度小于0.90。將構建成功的40只大鼠分為模型組和低、中、高劑量藥物組，每組10只；另取10只未處理大鼠作為對照組。其中，低、中、高劑量藥物組大鼠以2.5、5和10 mg/kg人參皂苷Rg1灌胃，模型組和對照組大鼠以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續14 d。

1.3 蘇木精?伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌組織病理形態并行積分統計麻醉處死大鼠后，取心肌組織；以4%多聚甲醛固定后制備石蠟切片并行常規的HE染色，在光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織結構變化，并參照文獻［10］方法統計大鼠心肌組織病理積分，即以心肌組織中壞死細胞及炎性細胞浸潤面積與視野內總面積的百分比表示病變面積；病變面積≥75%記4分，50%～＜75%記3分，25%～＜50%記2分，＜25%記1分，無病變記0分。

1.4 心臟彩超檢測大鼠心功能指標藥物干預結束后，麻醉并固定大鼠，分離右側頸總動脈，使用心臟彩超測定大鼠心功能指標，包括左室舒張壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室最大舒張速率（?dP/dtmax）和左室最大收縮速率（+dP/dtmax）值。

1.5 ELISA法檢測血清中BNP、cTnI和CK?MB含量大鼠處死后，開胸腔取左心室血液，以4 000 r/min離心10 min收集上清液，參照ELISA試劑盒說明書檢測BNP、cTnI和CK?MB含量。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測心肌組織中白細胞介素（IL）?6、IL?1β和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）mRNA水平采用Trizol法抽提心肌組織總RNA后，將其逆轉錄合成cDNA；以cDNA為模板，根據上海生工合成的引物在設定的擴增條件下進行PCR擴增。心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?α水平以2?ΔΔCt法計算，以β?actin為內參。擴增條件：95℃4 min；95℃15 s、58℃30 s，35個循環。IL?6：上游引物5'?ATTG?TATGAACAGCGATGATGCAC?3'，下 游 引 物5'?CCAGG?TAGAAACGGAACTCCAGA?3'，擴增片段長度為528 bp；IL?1β：上游引物5'?CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA?3'，下游引物5'?CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA?3'，擴增片段 長 度 為809 bp；TNF?α：上 游 引 物5'?GCCACCAC?GCTCTTCTGTCT?3'，下游 引 物5'?TCTCCCTCCCCAACTCT CCT?3'，擴增片段長度為701 bp；β?actin：上游引物5'?CCCATCTATGAGGGTTACGC?3'，下游引物5'?TTTAATGT?CACGCACGATTT?3'，擴增片段長度為252 bp。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測心肌組織中cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2、Bax、TLR4、MyD88、NF?κB p65和p?NF?κB p65蛋白表達水平向心肌組織中加入組織裂解液抽提組織總蛋白后，以二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品行電泳分離后，電轉至聚偏氟乙烯膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，β?actin、cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2、Bax、TLR4、MyD88、NF?κB p65和p?NF?κB p65一抗4℃孵育過夜；辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h后，化學發光劑顯影曝光。以β?actin為內參，采用凝膠成像分析系統掃描分析各組目的蛋白表達水平。

1.8 統計學方法采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，實驗中所得數據均以均數±標準差（x±s）表示，以單因素方差分析對多組間數據進行比較，以SNK?q檢驗進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態和積分的比較對照組大鼠心肌組織中心肌細胞呈整齊排列，組織結構基本正常；模型組大鼠心肌組織中心肌細胞排列紊亂且腫脹變形，肌纖維部分斷裂且伴隨有炎性細胞浸潤；相對模型組，低、中、高劑量藥物組大鼠心肌組織中上述細胞形態變化明顯改善，見圖1。模型組大鼠心肌組織病理積分（3.55±0.42）較對照組（0.09±0.08）明顯升高，低劑量藥物組（2.63±0.36）、中劑量藥物組（1.86±0.25）、高劑量藥物組（0.79±0.11）大鼠心肌組織病理積分逐漸降低，且均低于模型組（n=10，F=248.641，P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes of myocardial tissue in each group(HE staining,×100)圖1 各組大鼠心肌組織病理形態學變化（HE染色，×100）

2.2 人參皂苷Rg1對大鼠心功能的影響模型組大鼠心功能指標LVDP、?dP/dtmax以及+dP/dtmax較對照組明顯降低，LVEDP明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量藥物組LVDP、?dP/dtmax和+dP/dtmax顯著升高，而LVEDP顯著降低（P＜0.05），且隨著藥物劑量的升高，上述變化越明顯。見表1。

2.3 人參皂苷Rg1對大鼠血清中BNP、cTnI和CK?MB含量的影響與對照組比較，模型組大鼠血清中BNP、cTnI和CK?MB含量均明顯升高（P＜0.05）；但低、中和高劑量藥物組BNP、cTnI和CK?MB含量明顯低于模型組（P＜0.05），且隨著藥物劑量的升高，BNP、cTnI和CK?MB含量降低越明顯。見表2。

2.4 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平的影響與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量藥物組IL?6、IL?1β和TNF?αmRNA水平較模型組明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3。

Tab.1 Comparison of cardiac function indexes between five groups of rats表1 各組大鼠心功能指標比較（n=10，x±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of BNP,cTnI and CK-MB between five groups of rats表2 各組大鼠血清中BNP、cTnI和CK-MB含量比較（n=10，x±s）

Tab.3 Comparison of mRNA levels of IL-6,IL-1βand TNF-αin myocardial tissue between five groups of rats表3 各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平比較 （n=10，x±s）

2.5 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中凋亡蛋白cleaved caspase?3、procaspase?3、Bcl?2和Bax表達的影響模型組中cleaved caspase?3/procaspase?3和Bax/Bcl?2比值較對照組明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量藥物組中cleaved caspase?3/procaspase?3和Bax/Bcl?2比值逐漸降低，且均低于模型組（P＜0.05）。見表4、圖2。

Tab.4 Comparison of cleaved caspase-3/procaspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio in myocardial tissue of rats between five groups表4 各組大鼠心肌組織中cleaved caspase-3/procaspase-3和Bax/Bcl-2比值比較 （n=10，x±s）

Fig.2 The expression of procaspase?3,cleaved caspase?3,Bcl?2 and Bax protein detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測procaspase?3、cleaved caspase?3、Bcl?2和Bax蛋白表達

2.6 人參皂苷Rg1對大鼠心肌組織中TLR4/NF?κB信號通路的影響模型組大鼠心肌組織中TLR4/NK?κB信號通路相關蛋白TLR4、MyD88和p?NF?κB p65表達水平較對照組明顯升高（P＜0.05），低、中和高劑量藥物組中TLR4、MyD88和p?NF?κB p65蛋白表達水平較模型組明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表5、圖3。

Tab.5 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway related protein expression levels in myocardial tissue of rats between five groups表5 各組大鼠心肌組織中TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平比較 （n=10，x±s）

Fig.3 The expression of TLR4/NF?κB signaling pathway related proteins detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測TLR4/NF?κB信號通路相關蛋白表達

3 討論

3.1 人參皂苷Rg1對重癥肺炎心肌損傷的保護作用重癥肺炎是一種常見的臨床危重癥，心肌損傷作為其常見并發癥可導致患者心功能障礙甚至心力衰竭［11］。本研究在構建的重癥肺炎大鼠中發現，大鼠心肌組織病理積分升高，心功能指標LVEDP升高，而LVDP、?dP/dtmax和+dP/dtmax降低；同時，大鼠血清中心肌損傷指標cTnI、BNP和CK?MB含量明顯升高。結果表明，在構建的重癥肺炎大鼠中，其心肌組織明顯受損。以低、中和高劑量的人參皂苷Rg1干預后發現大鼠LVDP、?dP/dtmax、+dP/dtmax水平逐漸升高，而心肌組織病理積分、LVEDP和cTnI、BNP、CK?MB含量逐漸降低。結果表明，人參皂苷Rg1可呈劑量依賴性減輕重癥肺炎大鼠心肌損傷，提示其對重癥肺炎心肌損傷具有一定的保護作用。

3.2 人參皂苷Rg1可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應重癥肺炎患者處于一種嚴重的炎癥狀態，重癥肺炎合并心肌損傷患者的炎癥反應隨著病原菌的復制和免疫力的下降，持續擴散至包括心肌組織在內的全身各個組織器官，而炎性細胞浸潤又可引起心肌細胞變性壞死和凋亡，最終導致心肌組織損傷［12］。研究顯示，人參皂苷Rg1可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR?γ）介導的炎癥反應來改善大鼠心肌缺血再灌注后的心律失常，還可通過降低鈣敏感受體抑制心肌細胞凋亡［13?14］。本研究發現，重癥肺炎大鼠的心肌組織中促炎因子IL?6、IL?1β、TNF?αmRNA表達水平和凋亡相關指標cleaved caspase?3/procaspase?3、Bax/Bcl?2比值明顯升高，而給予低、中和高劑量的人參皂苷Rg1干預后，大鼠心肌組織中上述指標變化明顯受到抑制。結果表明人參皂苷Rg1可抑制心肌組織炎癥反應和心肌細胞凋亡，進而發揮對重癥肺炎心肌損傷的保護作用。

3.3 人參皂苷Rg1可抑制TLR4/NK?κB信號通路活化TLR4是Toll樣受體家族成員，可通過識別相應配體經MyD88激活NK?κB炎癥通路促進炎性因子IL?6和IL?10等介質釋放，在天然免疫、炎癥反應和細胞凋亡等過程中發揮著重要作用，與心肌組織損傷的發生密切相關［15?17］。研究顯示，人參皂苷Rg1可抑制TLR4/NK?κB信號通路的活化［18?19］。本研究發現重癥肺炎大鼠的心肌組織中TLR4、MyD88和p?NK?κB p65蛋白表達水平明顯升高；給予人參皂苷Rg1干預后，TLR4、MyD88和p?NK?κB p65蛋白表達水平呈劑量依賴性降低，表明人參皂苷Rg1可抑制重癥肺炎大鼠心肌組織中TLR4/NK?κB信號通路的活化，提示其可能通過抑制該通路活化減輕炎癥反應和心肌細胞凋亡，進而起到保護重癥肺炎心肌損傷的作用。

綜上所述，人參皂苷Rg1可通過減輕炎癥反應和心肌細胞凋亡對重癥肺炎心肌損傷發揮保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4/NK?κB通路活化有關。本研究初步揭示了人參皂苷Rg1保護重癥肺炎心肌損傷的作用通路，但是否還與調控其他通路有關仍有待進一步探討。