膜蛋白FKBP38病理生理功能研究進展

尚畫雨，夏 志

FKBP38屬于FK506結合蛋白（FKBPs）家族，該蛋白家族成員作為肽基脯氨酰順反異構酶（PPIase），可通過不同的生物活性而調節底物蛋白，故被視為蛋白質折疊/轉換的重要限速環節（Edlich et al.，2006a）。由于FKBPs能夠作為免疫抑制劑FK506和/或雷帕霉素的受體，因此也被稱為免疫親和素。免疫親和素可與相應的免疫抑制劑形成緊密的復合物，進而成為另一細胞內靶點的共同結合位點。例如，FKBP/FK506復合物，可與鈣調磷酸酶（CaN）結合并抑制其磷酸酶活性；由于CaN活性直接影響轉錄因子，如活化T細胞核因子（NF-AT）的去磷酸化，因此，FKBP/FK506復合物亦可表現出經抑制T細胞增殖而抑制免疫應答的生物功能（Rao et al.，1997）。

FKBPs能夠保持PPIase催化活性并與FK506結合，與其呈現典型FKBP折疊的錐形“半β桶”結構內的疏水性口袋有關。除了這一PPIase結構域外，較大的FKBP（如FKBP38）通常還包含其他相互作用結構域，如TPR序列、鈣調蛋白（CaM）結合位點、富含谷氨酸（Glu-rich）區域、內質網（ER）信號區域或跨膜結構域等（Edlich et al.，2011），這些結構域賦予其更多的潛在生物學作用。例如，FKBP38可通過PPIase和TPR結構域（Choi et al.，2010）或CaM位點（Edlich et al.，2007）與B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）結合，誘發促凋亡效應；通過LIR氨基酸序列與微管相關蛋白1輕鏈3A（LC3A）相結合，介導線粒體自噬過程（Bhujabal et al.，2017）。鑒于細胞凋亡與自噬機制在運動模型中的研究，推測FKBP38可能通過與Bcl-2、LC3A互作而參與調節運動干預下的凋亡及自噬過程。目前運動對FKBP38的影響及其影響機制鮮見文獻報道。

1 FKBP38概述

FKBPs因能與免疫抑制劑FK506結合而命名，該家族蛋白高度保守，廣泛存在于原核和真核生物細胞中，并在腦、肺、腎臟和心臟等組織高表達。FKBP38亦稱FKBP8，是FKBPs家族成員之一，與FKBP12高度同源。這一多結構域蛋白由N端的Glu-rich區域、PPIase結構域、TPR序列、CaM結合位點和C端特有跨膜結構域組成（圖1）。FKBP38的跨膜結構域使其定位于線粒體等細胞膜表面，且其PPIase結構域上的催化位點可與FK506結合并抑制其PPIase活性（Edlich et al.，2011）。

圖1 FKBP38/CaM復合物結構圖（Edlich et al.，2011）Figure 1. Diagram of Composite Structure of FKBP38/CaM

FKBP38是一個多功能蛋白，目前研究認為，FKBP38由鈣信號感受器CaM激活（Edlich et al.，2007）。CaM/Ca2+可通過結合至FKBP38的C端CaM結合位點及N端CaM和PPIase區域之間的結合位點，激活其PPIase活性。其中，前者呈Ca2+依賴，后者并不依賴于Ca2+（Edlich et al.，2007；Maestre-Martinez et al.，2010）（圖1）。

目前，FKBP38與多種蛋白如非結構蛋白（NS5A）（Okamoto et al.，2006）、脯氨酰基4-羥化酶（PHDs）（Barth et al.，2009）、熱休克蛋白 90（HSP90）（Okamoto et al.，2006）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）（Bai et al.，2007）及其激活劑 Ras家族小 G蛋白Rheb（Ma et al.，2008）之間的互作已得到證實。研究表明，FKBP38蛋白還涉及多方面調節機制，如細胞大小調節（Rosner et al.，2003）；與ANKMY2相互作用（Saita et al.，2014）參與音猬因子（SHH）信號傳導，促進神經元發育（Cho et al.，2008）和生殖細胞腫瘤發展（Kuleszo et al.，2017）；結合CaM以激活Bcl-2（Choi et al.，2010）調節細胞凋亡等。目前，鮮見關于運動對NS5A直接影響的文獻報道，但有研究提示，激活mTOR通路（Moller et al.，2019）和/或沉默PHD2（Nunomiya et al.，2017）所誘導的低氧誘導轉錄因子（HIFs）活化，均可進一步提升長期運動訓練的健康收益。此外，PHD2/HIF-1α途徑可參與維持急性運動后肝細胞能量穩態（Luo et al.，2018），急性運動后維持細胞內蛋白結構和功能穩定作用的伴侶分子HSP90的蛋白表達在多種組織內均有顯著上調（Kruger et al.，2019），表明運動或骨骼肌收縮為骨骼肌組織乃至整個機體帶來健康收益（如肌肉肥大）的同時，可能也會產生許多負面效應。例如，正常肌肉在離心運動中被過度拉伸會導致第2個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑（Smac）、細胞色素C氧化酶亞基Ⅳ（COXⅣ）等一些肌細胞膜蛋白的丟失，從而誘發骨骼肌細胞凋亡（趙曉琴等，2014）或自噬性死亡（Shang et al.，2019）。提示膜蛋白FKBP38作為多種已知蛋白的互作因子/伴侶分子，可能在運動調節細胞質量控制中發揮重要作用。因此，研究應進一步加強運動干預對FKBP38功能表達的影響研究。

2 FKBP38的生物學功能

2.1 FKBP38參與調節細胞凋亡

細胞凋亡是由基因和細胞因子調控的細胞程序性死亡，該過程的紊亂將會導致諸如退行性疾病、自免疫疾病和癌癥等各種疾病的發生。FKBP38通過與包括Bcl-2、Bcl-XL等凋亡蛋白在內的各種調節因子的互作而調節細胞凋亡。其中，Bcl-2和Bcl-XL的抗凋亡作用與其線粒體定位密切相關，但其定位至線粒體的分子機制尚不明確。研究指出，在HeLa細胞內FKBP38可募集Bcl-2和Bcl-XL至線粒體，抑制線粒體依賴的細胞凋亡，且磷酸酶抑制劑FK506無法抑制FKBP38的抗凋亡作用（Chen et al.，2008）。FKBP38基因缺陷小鼠在出生后不久即因神經管閉合缺陷致死，推測其原因可能是過度的細胞凋亡（Shirane et al.，2008）。有學者構建了心肌特異性FKBP38缺陷模型小鼠，行主動脈縮窄術后發現，FKBP38介導半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）凋亡信號，并通過抑制錯誤蛋白的折疊和內質網依賴的細胞凋亡發揮心臟保護作用（Misaka et al.，2018），提示FKBP38可能具有抗凋亡活性，但同時亦有不同研究結果。

Maestre-Martinez等（2011）報道，神經元SH-SY5Y細胞內游離Ca2+濃度的升高可誘導FKBP38與CaM結合形成FKBP38/CaM/Ca2+復合物，促進FKBP38與Bcl-2的互作并最終誘導細胞凋亡。活化的FKBP38結合Bcl-2后可誘導構象重組，阻止Bcl-2和促凋亡蛋白（如Bad）之間的相互作用（Edlich et al.，2005）。研究發現，FKBP38的促凋亡活性為HSP90所抑制，HSP90可下調FKBP38/CaM/Ca2+復合物表達，阻止FKBP38和Bcl-2的相互作用，從而抑制細胞凋亡（Erdmann et al.，2007）。Edlich等（2006b）發現，FKBP38抑制劑DM-CHX在大鼠腦缺血模型中具有神經保護和神經再生特性，并推測FKBP38可能通過介導Bcl-2表達下調而特異性誘導腦細胞凋亡。因此，FKBP38可能是治療神經退行性疾病和癌癥等疾病的關鍵潛在靶點，其在細胞凋亡中的作用亦可能具有細胞類型特異性。

FKBP38最初在酵母雙雜交系統中被發現可與Bcl-2互作。Kang等（2005）認為，二者的結合是通過Bcl-2處于BH3和BH4結構域之間的一條長的易變環（flexible loop）而實現，兩蛋白間的互作可抑制易變環磷酸化，促使Bcl-2被caspase-3降解而導致細胞凋亡。Choi等（2010）認為，FKBP38的PPIase和TPR結構域主要通過影響Bcl-2的易變環與Bcl-2結合。Edlich等（2007）的細胞實驗發現，FKBP38催化域與Bcl-2之間的結合具有CaM依賴性，FKBP38得以活化而抑制Bcl-2，誘發促凋亡效應。Haupt等（2012）指出，存在靜電作用促使FKBP38和Bcl-2之間的瞬時復合物形成。Wang等（2005）發現，FKBP38可通過與早老蛋白（PSEN）和Bcl-2相互作用將后者定位至內質網。Nie等（2017）的報道表明，Smyd1第3種非催化亞型Smyd1C可與Bcl-2、FKBP38和CaN結合形成復合物，且該復合物可促進Bcl-2磷酸化表達，增強其線粒體定位，抑制CD8 T細胞凋亡。目前的研究結果均提示，FKBP38是作為Bcl-2的分子伴侶而發揮活性，關于二者結合作用的結果分歧主要在于：1）FKBP38/Bcl-2二者接觸區域的定位；2）對外在附加成分的依賴性；3）相互作用的促凋亡或抗凋亡性質。上述結果表明，FKBP38和Bcl-2的相互作用對于Bcl-2的穩定性和功能以及在生理和病理條件下的細胞凋亡調節中起關鍵作用。

2.2 FKBP38參與調節細胞缺氧反應

目前誘發阿爾茲海默癥（AD）的潛在病理過程尚未明確，但有研究證實，組織缺氧和灌注不足會誘導淀粉樣前體蛋白（APP）表達和β-淀粉樣蛋白（Aβ）等生成，APP等眾多I型膜蛋白可被γ-分泌酶復合物切割裂解，生成Aβ和APP胞內結構域（AICD）。其中AICD可進一步介導HIF-1α表達并誘導缺氧反應，這一過程與家族性阿爾茲海默癥（FAD）的病理進程密切相關（Zhang et al.，2010）。PSEN1和PSEN2均通過其與FAD的基因連鎖而被發現，作為γ-分泌酶復合物形成的催化核心，Wang等（2005）證實，PSEN1/2能與FKBP38相互作用，并抑制FKBP38的抗凋亡功能。Barth等（2009）發現，FKBP38還能特異性結合PHD2，并通過蛋白酶體作用促進PHD2降解。由于二者的結合發生在PHD2的N端區段和FKBP38的Glu-rich區域之間，因此這一結合作用與FKBP38的PPIase催化活性無關（Barth et al.，2009）。使用siRNA沉默缺氧細胞內的FKBP38基因可致PHD2活性升高及HIF-1ɑ蛋白表達下調，且恢復FKBP38表達可逆轉此變化，這表明即使在低氧條件下PHD2活化也會導致HIF-1ɑ兩個保守的脯氨酸殘基被PHD2羥基化降解，從而抑制HIF-1ɑ功能（Barth et al.，2007）。

Kaufmann等（2013）推測，PSEN可通過抑制FKBP38而增加PHD2活性，進而調控缺氧信號通路。該研究組培養與Wang等（2005）同樣的MEF細胞并沉默PSEN1/2基因后發現，FKBP38蛋白表達上調，PHD2和HIF-1α蛋白表達下調，導致細胞內缺氧反應減弱，且這一作用效應依賴于AICD的生成（圖2），提示FKBP38可與PSEN1/2及PHD2互作，對細胞缺氧反應發揮負向調節作用。

圖2 FKBP38/PHD2參與PSENs對HIF的調節（Kaufmann et al.，2013）Figure 2. FKBP38/PHD2 Participates in the Regulation of HIF by PSENs

2.3 FKBP38作為受體蛋白介導線粒體自噬

線粒體自噬是指在應激條件下，細胞內的線粒體出現去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹進入自噬體中并與溶酶體融合，從而完成受損線粒體的降解，維持細胞內環境的穩定。研究表明，線粒體自噬在線粒體質量控制（MQC）中的清除作用較非特異細胞自噬更為顯著，自噬引起的線粒體選擇性減少與線粒體生物發生協同作用，從而保持線粒體數量穩定。在哺乳動物體內，除PINK1（PTEN-induced putative kinase protein 1）/Parkin（Parkinson protein 2）作為與神經系統關系密切的線粒體自噬途徑外，介導包括骨骼肌線粒體自噬途徑的主要為Nix/Bnip3L（BCL2/adenovirus E1B protein-interacting protein 3-like）、Bnip3、FUNDC1 和 FKBP38（Bhujabal et al.，2017；Triolo et al.，2019）。Nix是Bcl-2家族中只含BH3結構域亞家族中的一員，與Bnip3共同參與哺乳動物細胞中低氧損傷線粒體的清除，這對于降低ROS水平和維持氧穩態極為重要。研究發現，低氧作為重要的應激條件，可激活HIF-1，誘導Nix與Bnip3高表達，一方面阻止Bcl-2與Beclin-1相結合，使得Beclin-1從Bcl-2/Beclin-1復合物中解離出來誘發自噬；另一方面，Nix與Bnip3分別募集GABARAP-L1和LC3B至損傷線粒體，進而激活線粒體自噬。此外，FUNDC1可通過特有的WXXL樣氨基酸序列與LC3B結合共同調控線粒體自噬過程，而低氧刺激可促進其相互作用，使受損線粒體被自噬體包裹（Chen et al.，2016）。但關于低氧損傷的線粒體被選擇性清除的分子機制仍未徹底闡明。線粒體外膜蛋白FKBP38亦為介導線粒體自噬的受體蛋白，目前已成為哺乳動物細胞線粒體自噬的分子調控新靶點。

線粒體分裂通常先于線粒體自噬發生。Bhujabal等（2017）通過免疫染色線粒體外膜蛋白TOM20觀察到FKBP38過表達的HeLa細胞中呈現線粒體分裂和核周聚集等明顯的形態變化（圖3）。上述這些變化與現已明確的自噬受體Nix和Bnip3過表達誘導的線粒體形態變化相似。由此可見，FKBP38可介導線粒體顯著形態變化及降解。值得注意的是，FKBP38過表達足以誘導線粒體分裂和聚集，且這一誘導效果不依賴于羰基氰化物氯苯腙（CCCP）處理作用或自噬相關基因8（ATG8）家族蛋白的共表達。

圖3 FKBP38介導的線粒體自噬（Bhujabal et al.，2017）Figure 3. FKBP38-Mediated Mitophagy

Shirane-Kitsuji等（2014）研究證實，在PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬過程中，FKBP38通過微管從線粒體轉位至內質網，并招募抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL至線粒體，抑制線粒體依賴的細胞凋亡，提示Parkin介導的線粒體降解不依賴于FKBP38。Bhujabal等（2017）發現，FKBP38可通過特有的LIR氨基酸序列與LC3A相結合，共同調控線粒體選擇性自噬過程（圖3），且該作用不依賴于PINK1/Parkin通路。當受損線粒體被自噬體包裹時，FKBP38又會從酸化的線粒體轉位至內質網以避免其自身被降解，并推測FKBP38的逃逸轉位依賴于其C端弱堿性序列和在線粒體自噬期間對凋亡的抑制作用（Saita et al.，2013）。目前，線粒體自噬降解過程中FKBP38逃逸轉位的發生機制尚有待進一步研究闡明。同時，尚未明確FKBP38作為線粒體自噬受體究竟如何被激活，亦不清楚其與自噬相關蛋白 optineurin、NDP52、TAX1BP1、p62/SQSTM1和NBR1等泛素化底物（Lazarou et al.，2015；Richter et al.，2016）究竟是否存在互作。其布日等（2016）利用酵母雙雜交技術篩選FKBP38相關蛋白，發現FKBP38可與p62產生相互作用，為后續關于氨基酸信號轉導分子機制的研究提供了線索。FKBP38在促/抗凋亡信號、調節mTOR和線粒體自噬中的不同作用究竟如何整合至協調反應過程中，亦有待厘清。

目前已知的線粒體自噬蛋白可以靶向招募一種特定的ATG8蛋白而介導自噬發生，如Nix可招募GABARAPL1（Novak et al.，2010），Bcl-2-L13（Murakawa et al.，2015）、Bnip3（Hanna et al.，2012）和 FUNDC1（Liu et al.，2012）則均招募LC3B。因此，在介導線粒體自噬和參與MQC過程中受體蛋白FKBP38、BNIP3、NIX、FUNDC1和Bcl2-L13之間可能存在的相互作用或競爭性表達機制均具有深入研究的價值。Bhujabal等（2017）發現，FKBP38和LC3A共定位作用在CCCP處理后顯著增強，CCCP如何誘導FKBP38與LC3A發生明顯共定位，將是今后研究的重要問題之一。

2.4 FKBP38參與調節mTOR功能活性

mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞周期調節和細胞生長等許多生理調節過程中發揮核心作用。研究表明，FKBP38可與mTOR結合（De Cicco et al.，2018b），但在不同的氨基酸和生長因素影響下，二者的互作并不相同。

在氨基酸或生長因素被剝奪的情況下，FKBP38通過其與FKBP12高度相似結構域和mTOR結合并以類似于FKBP12-雷帕霉素復合物的方式抑制mTOR活性（Bai et al.，2007）。因此，FKBP38被視作一種不依賴于雷帕霉素的內源性mTOR抑制劑（Fu et al.，2015）。此外，Bai等（2007）指出，雷帕霉素雖能進一步增強FKBP38對mTOR的抑制效應，但同時FKBP38與mTOR之間的結合受到阻遏，其具體機理仍不明確。當氨基酸和生長因子充足時，FKBP38將與Rheb相結合，后者解除其對mTOR的抑制作用，使mTOR活性得以恢復（Bai et al.，2007）。有報道指出，FKBP38可以調節Rheb的功能活性（de Cicco et al.，2018a）。因此，FKBP38可能是Rheb調節mTOR通路的中間調控因子（Zheng et al.，2014）（圖4）。

圖4 FKBP38、Rheb和mTORC1之間的相互作用關系（Zheng et al.，2014）Figure 4. Interaction among FKBP38，Rheb and mTORC1

就FKBP38對mTOR的影響及機制而言，目前尚存爭議。Wang等（2008）認為，Rheb結合FKBP38與氨基酸水平或胰島素作用無關。該研究在HEK293細胞中發現FKB3P8與mTOR相結合，但并未檢測到FKBP38對mTOR的抑制作用，故推測FKBP38調控mTOR的差異性反應取決于特定的細胞條件。研究應進一步闡明Rheb、FKBP38和mTOR之間的互作與機制，且FKBP38及與其相互作用的蛋白對于不同細胞環境的應答，有待后續研究予以證實。

mTOR信號通路中包含多個抑癌基因（如PTEN、LKB1、TSC1、TSC2），因此，mTOR內源性抑制劑FKBP38被認為與腫瘤等疾病的發生緊密相關。研究表明，FKBP38是內質網信號肽酶（SPP）的作用底物之一，SPP可通過下調FKBP38表達而激活mTOR信號通路，促進腫瘤的發生發展（Hsu et al.，2019）。賴姨梅等（2018）分析了FKBP38蛋白在卵巢上皮性腫瘤（EOC）中的表達，發現FKBP38蛋白表達在正常輸卵管組織、卵巢上皮性良性腫瘤和交界性腫瘤之間未見差異，但其在EOC的表達明顯下調，提示FKBP38蛋白可能在EOC的發生過程中參與抑癌作用，其作為EOC診斷和治療的潛在生物靶點尚需進一步探索和研究。王帥等（2017）構建了FKBP38肝臟組織特異性敲除小鼠模型，發現FKBP38缺失后mTOR下游信號分子p70核蛋白體S6激酶（p70S6K）磷酸化輕微上調，真核翻譯起始因子4E結合蛋白（4EBP1）輕微下調，Bcl-2蛋白無明顯變化，但FKBP38對mTOR的抑制作用以及對Bcl-2的保護作用并未闡明。因此，FKBP38在調節mTOR通路誘導細胞生長和凋亡方面的作用亟待深入研究，其對于了解腫瘤的增殖和凋亡過程，以及探索抗腫瘤治療的新方法均具有重要意義。

2.5 FKBP38參與調節丙肝病毒復制

關于丙型肝炎病毒（HCV）如何逃避機體清除的分子機制尚不明確，但HCV通過抗細胞凋亡作用使其持續復制無疑是致病機制之一。現已證實，HCV的非結構蛋白5A（NS5A）（即丙型肝炎病毒HCV復制酶的亞基之一）可在內質網和線粒體上與FKBP38特異性互作（Okamoto et al.，2006；Wang et al.，2006），且NS5A的抗凋亡作用亦特異性依賴于 FKBP38（Wang et al.，2006）。Li等（2016）在對經典豬瘟病毒（CSFV）的研究中也證實，NS5A蛋白通過與FKBP38相互作用而正向調控CSFV復制。在人體肝癌細胞系Huh7中通過siRNA沉默FKBP38基因導致HCV復制被抑制，且FKBP38的TPR序列可介導FKBP38與NS5A及HSP90間的互作，表明HCV復制過程存在FKBP38依賴（Okamoto et al.，2006）。Lee等（2016）的研究證實，FKBP38與NS5A、Hsp90三者形成NS5A-FKBP38-Hsp90復合物，從而調節HCV復制。有研究發現，S100蛋白家族的成員如 S100A1、S100A2、S100A6、S100B 和S100P以Ca2+依賴的方式與FKBP38的TPR序列特異性結合，同時抑制 FKBP38與NS5A、Hsp90（Tani et al.，2013）及 FKBP38與 Bcl-2、Hsp90間（Shimamoto et al.，2014）的互作。基于此，通過上調細胞內Ca2+濃度的方式誘導FKBP38和S100蛋白相結合，可能有效抑制HCV復制，而NS5A-FKBP38-Hsp90三聯復合物在HCV復制中發揮關鍵作用。其中，FKBP38是三聯復合物形成的必要因素。

Blundell等（2017）指出，FKBP38蛋白是通過羧酸鹽叢樣結構與Hsp90羧基末端的MEEVD結構相互作用。FKBP38-Hsp90復合物能通過促進骨骼肌特異性氯通道-1（CLC-1）的生物合成從而參與調控CLC-1質量控制，在誘導先天性肌強直的發生發展過程中發揮重要負向保護作用（Peng et al.，2016，2018）。NS5A和FKBP38之間的相互作用可引起后者構象發生改變，阻止FKBP38與mTOR的結合，活化mTOR抑制細胞凋亡，這可能是HCV慢性感染轉變為肝細胞肝癌的重要發生機制之一（Peng et al.，2010）。以上結果提示，靶向NS5A或靶向NS5A調節的信號通路（如FKBP38/mTOR信號通路）的藥物（如免疫親和素），可能成為未來治療病毒感染的候選藥物之一。因此，FKBP38作為分子靶點對于抗病毒治療的發展，可能具有至關重要的影響。

3 結論與展望

作為一種多功能蛋白，FKBP38在多種信號通路中均不可或缺。其不僅具有促/抗凋亡活性，且能介導線粒體自噬的發生，并作為mTOR的內源性抑制劑發揮抗腫瘤侵襲和轉移的功能，在HCV復制過程中亦有重要貢獻。后續應考慮在體內或體外的不同應激狀態下，或在病毒、腫瘤模型中，深入研究FKBP38與其他相關通路以及調節因子的相互作用，以期探明FKBP38在調節凋亡信號、mTOR信號和線粒體自噬等過程中的不同作用究竟如何整合至協調反應之中。這一特殊的FKBPs家族蛋白很可能成為藥物和/或運動干預等諸多獨立生物進程中的共同靶點。