新型歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 在畢赤酵母中的表達

張麗娟 吳唯維 李素一 陳 華 柯翎 林晨韜

（1.福建省農業科學院生物技術研究所 福州 350003；2.福建師范大學生命科學學院 福州 350007；3.福建師范大學南方海洋研究院福建省微藻種質改良工程技術研究中心 福州 350117；4.福建師范大學福建省特色海洋生物資源可持續利用重點實驗室 福州 350117）

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是一類由生物機體產生的具有抑菌活性的陽離子多肽類物質， 是機體抵御病原菌感染的天然屏障之一。近年來，由于尋找抗生素替代物的迫切需求， 以及抗菌肽的抗菌活性高、抗菌譜廣、種類多、目標菌株不易產生耐藥突變等特點， 其作為一種潛在的抗生素替代物越來越受到研究者的重視[1-2]。

目前， 抗菌肽的獲得方式主要是從生物體中提取、人工化學合成和構建基因工程菌大量表達。其中從生物體中提取只能獲得少量抗菌肽，且操作復雜；人工化學合成抗菌肽成本高且與天然抗菌肽的結構有差異；而構建基因工程菌大量表達則具效率高、成本低且易操作等優點。 基因工程表達主要包括原核表達系統與真核表達系統， 其中酵母表達系統作為常用的真核表達系統， 表達的抗菌肽更接近天然狀態， 并且操作簡單、 無毒副作用、 利于純化及工業化生產[3]。 Sun 等[4]利用畢赤酵母表達了融合蛋白抗菌肽乳鐵蛋白-溶菌酶， 具有良好的穩定性。 Meng等[5]利用畢赤酵母重組表達的Hispidalin 具有廣譜的抗菌活性， 并且具有廣泛的熱穩定性與酸堿穩定性。

我們前期從歐洲鰻鱺中發現一個新型抗菌肽elecilin，并對其進行了原核表達，證實其對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用（另文發表）。 本研究利用酵母表達系統， 獲得了分泌到培養基中大量表達的elecilin， 為闡明其功能及其在生產實踐中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 畢赤酵母X-33 和酵母分泌表達載體pPICZaA 由本實驗室保存。 限制性內切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ、Taq DNA polymerase、T4 DNA 連接酶、DNA ladder 購自TaKaRa 公司；抗生素Zeocin、抗體anti-His 單克隆抗體購自Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽的序列特征分析 根據歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 基因編碼的氨基酸序列， 利用BioEdit 軟件預測蛋白質的疏水區和親水區，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在線預測信號肽信息，https://swissmodel.expasy.org/interactive 在線預測蛋白的三級結構，PROSITE 數據庫分析蛋白的活性區域。

1.2.2 基因序列合成與酵母分泌表達載體的構建為利于抗菌肽的表達， 根據獲得的歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列，及酵母表達系統的密碼子偏好性， 在不改變編碼氨基酸序列的基礎上合成去除信號肽的elecilin 基因序列，并在其上游與下游分別引入Xho Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點。 將合成的目的基因序列與Xho Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切回收的pPICZaA 在T4 DNA 連接酶作用下進行連接，經鑒定后，獲得質粒pPICZaA-elecilin。

1.2.3 酵母菌的電擊轉化和陽性轉化子的PCR 篩選 按照電擊轉化步驟， 將質粒pPICZaA-elecilin轉化至畢赤酵母X-33 感受態中。 轉化后，均勻涂布于RDB 平板中，30 ℃培養3 d。 挑取若干單克隆酵母 菌， 用 引 物ɑ factor sequencing primer：TACTATTGCCAGCATTGCTGC 和 3' AOX primer：GCAAATGGCATTCTGACATCC 進行PCR 驗證。

1.2.4 抗菌肽的誘導表達及SDS-PAGE 鑒定 選取鑒定為陽性的克隆菌接種至BMGY 培養基，28 ℃培養至OD600為3.0 后，700 g/min 離心5 min， 收集菌體，并用新鮮的BMMY 培養基重懸菌體，至OD600為1.0，28 ℃繼續培養， 每隔24 h 添加甲醇溶液（100%） 至終濃度為1 %誘導蛋白表達， 誘導96 h后收集培養基， 用SDS-PAGE 鑒定抗菌肽表達情況。

1.2.5 表達產物的Western blot 鑒定 分泌蛋白經SDS-PAGE 電泳后， 電轉移至PVDF 膜上， 半干轉90 min 后，將PVDF 膜用封閉液封閉2 h，然后洗脫液PBST 洗脫4 次，每次5 min，將膜與一抗（His-tag單克隆抗體） 在室溫孵育1～2 h 后， 洗脫液洗脫（4 次，每次5 min），然后將膜轉移到二抗溶液（含有辣根過氧化物酶標記的馬抗鼠IgG）中，室溫孵育1～2 h， 接著洗脫液洗脫， 用ECL 顯色系統顯色，在BIO-RAD 中顯色后拍照。

2 結 果

2.1 歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列特征分析歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 基因序列全長477 bp，編碼159 個氨基酸，理論分子量約為17.4 kDa（見圖1）。信號肽分析發現， 前30 位氨基酸為信號肽區域；三維結構預測， 該蛋白在84-106 區間是一個活性區域，含有2 個抗菌肽標簽特征序列。

圖1 歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列

2.2 酵母分泌表達載體的構建與重組轉化子的PCR 鑒定 合成的elecilin 基因序列與酵母分泌表達載體pPICZaA 連接后， 得到elecilin 的酵母表達質粒pPICZaA-elecilin。 將其電擊轉化至酵母菌X-33 中，在RDB 平板中培養3 d 后挑取單克隆，培養后， 用 引 物ɑ factor sequencing primer 和3' AOX primer 進行PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示陽性克隆菌株擴增出與目的基因大小一致的片段 （見圖2）。 進一步的測序結果表明，elecilin 基因已成功整合到酵母基因組中， 將陽性轉化子命名為X-33/pPICZaA-elecilin。

圖2 重組菌株X-33/pPICZaA-elecilin 的PCR 鑒定

2.3 抗菌肽的誘導表達及鑒定 將重組酵母進行甲醇誘導培養，收集培養基進行SDS-PAGE 分析和Western 鑒定。 結果顯示，培養基中檢測到一個分子量約17 kDa 的蛋白表達（見圖3）。 進一步根據表達產物攜帶6×His 標簽的特點，利用抗His-tag 單克隆抗體進行Western blot 驗證，在約17 kDa 處的蛋白與該抗體特異性結合（見圖4），證明目的蛋白在酵母菌X-33 中成功表達。

3 討 論

圖4 Western blot 鑒定elecilin 的表達

迄今為止，已發現的抗菌肽超過3 000 種，其中動物源抗菌肽超過2 000 種。 雖然抗菌肽種類及數量在不斷增多，但是被廣泛應用的卻很少，究其原因包括抗菌肽在機體內的代謝情況尚不清楚、 安全性評價體系尚不完善、抗菌肽的生產成本高等[6]。 在抗菌肽的研究中， 畢赤酵母表達系統因其操作簡單、表達高效、 且活性高等特點被廣泛用于抗菌肽的表達[7]。 本研究根據畢赤酵母密碼子偏好性，在不改變elecilin 的編碼氨基酸序列基礎上，合成了去除信號肽的DNA 序列， 構建了真核表達質粒pPICZaAelecin，利用畢赤酵母X-33 進行了表達，用甲醇誘導表達，經SDS-PAGE 與Western blot 鑒定，成功在畢赤酵母中表達了elecilin。 在此基礎上，我們將分析其抗菌譜，進一步研究其功能，評估其在水產和畜禽等領域的應用價值。