豬克隆技術的研究進展

李兆龍 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013

1 動物克隆技術簡介

動物克隆是一種不經過有性生殖過程， 生產遺傳結構與細胞核供體相同動物個體的技術， 就叫做動物克隆。到目前為止，已經報道了6 種不同的方法來生產克隆動物[1-2]。

1.1 胚胎分割克隆技術 胚胎分割是動物克隆早期的一種技術， 它將一個沒有著床的早期胚胎運用顯微方法一分為二、四或更多，然后將其移植給受體進行分娩（見圖1）。 通常一個胚胎可以克隆兩個以上的后代，且后代的遺傳性狀完全相同。 當前，用胚胎二分法克隆的動物包括鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和馬。我國除了馬，以上克隆動物都有。 該技術較為原始，容易破壞細胞[3-5]。

1.2 胚胎細胞核移植 將未植入的早期胚胎細胞（有絲分裂球）通過顯微手術分離，然后將其單個胚胎細胞導入去除染色質的未受精成熟卵母細胞。 然后采用電融合法充分融合，分化發育成新胚胎。再將新胚胎移植到受體子宮中分娩（見圖2）。 目前，國外有鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴成功移植。我國也克隆了鼠、兔、山羊、綿羊、豬和牛。 這項技術比胚胎分割更進一步，將克隆更多的動物[6-7]。

圖1 胚胎分割克隆技術

圖2 胚胎細胞核移植

1.3 胚胎干細胞核移植 胚胎或胎兒原生細胞被抑制分化后， 細胞數量呈指數增長， 但細胞沒有分化，每個細胞具有發育成個體能力[8]。 將單細胞導入成熟的卵母細胞克隆胚胎中，然后移植到受體上，產生妊娠、產仔和克隆出動物（見圖3）。 胚胎干細胞被引入早期胚胎時，ES 細胞具有多能性的體外增殖能力，并形成嵌合體[9-10]。交配生殖系嵌合體后，可以獲得來自ES 細胞的動物[11]。 在小鼠中，ES 細胞和基因靶向技術已經成為將期望的遺傳變化引入基因組的常規程序[12]。除了鼠之外，還報道了ES 細胞，如倉鼠、兔、鼠、豬、恒河猴、牛和人類[13-14]。 有限數量的報告通過在鼠體內產生嵌合體驗證了ES 細胞的多能性，但沒有證實生殖系嵌合體。 因此，目前ES 細胞只能用于克隆動物的產生或小鼠的靶向突變。

圖3 胚胎干細胞核移植

1.4 胎兒成纖維細胞核移植 孕早期從胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，通過核移植，移植受體，妊娠仔豬和克隆個體克隆胚胎（見圖4）。 英國在1996 年報告克隆了三只山羊[15]。

圖4 胎兒成纖維細胞核移植

1.5 體細胞核移植 對動物的體細胞進行抑制和休眠， 然后通過核移植將去除染色質的成熟卵母細胞導入胚胎，然后移植到受體、妊娠和出生來克隆動物（見圖5）。 理論上，該方法能不受限制地克隆個體。這一技術的突破在科學和生產應用價值上，可以與原子彈的初始爆炸相當[16]。

1.6 胚胎嵌合 將兩個胚胎細胞（同種或異種動物胚胎）融合，共同發育成一個稱為嵌合胚胎[17]。 然后將嵌合胚胎轉移到受體妊娠， 生產具有上述兩種動物胚胎的動物稱為嵌合動物 （見圖6）。 嵌合體這個詞起源于希臘神話，指的是一頭獅子的頭，一只羊的身體，還有一條龍的尾巴的怪物。 像一只黑老鼠和一只白老鼠的胚胎嵌合體一樣， 黑白花老鼠誕生了。不同種類的綿羊與山羊胚胎細胞嵌合，可產生綿羊，兼有兩種羊的特征。該技術被廣泛應用于發育生物學、免疫學和醫學動物模型的研究。

圖5 體細胞核移植

圖6 胚胎嵌合

2 豬的胚胎克隆

2.1 豬克隆技術簡介 豬的克隆技術不僅有助于提高優勢動物的產量， 而且也有助于生產具有不含異種移植抗原器官的敲除動物， 或分析分離的人類基因的功能。 生產克隆豬的策略見圖7。 目前，豬克隆技術已逐漸從胚胎克隆轉移到體細胞克隆， 主要包括細胞活化、選擇供體細胞、胚胎培養和誘導與維持妊娠等方面：（1）供體細胞的收集。 從屠宰場采集的卵巢中可以獲得大量的未成熟卵母細胞， 通過體外成熟和體外受精獲得成熟卵母細胞和胚胎。（2）卵母細胞分離、篩選和去核。 威拉德森實驗證明，MⅡ階段成熟卵母細胞比受精卵更適合克隆[18]。因此，所有豬克隆都選擇MⅡ期卵母細胞作為核移植受體細胞。通過盲吸、半卵或功能性去核來去除細胞核。（3）核細胞的分離、培養和核提取。豬的核供體細胞可分為胚胎細胞（受精卵)和體細胞(乳腺細胞、耳皮細胞、顆粒細胞等）兩類。 細胞核通常通過顯微手術吸出。（4）胚胎的重建。短時間內吸出供體核，打入受體卵細胞，然后融合重建的胚胎，促進核卵重組。（5）重建胚胎的移植。 將重建的胚胎在體外培養一定時間， 直到發育到囊胚階段， 然后將其移植到發情母豬的子宮和輸卵管中， 使母豬懷孕并生產新的克隆個體。

圖7 豬克隆技術

2.2 豬克隆研究進展 伴隨1997 年“多利”羊的誕生，開創了動物克隆的新歷史。作為與人類關系密切的豬，自然也引起了科學家研究的興趣?？寺∝i最早報道是在1981 年，Hoppe 等采用顯微去核和病毒介導方法， 將一個4 細胞期卵裂球的核移入一個去核的卵母細胞中獲得克隆豬[11]。 2001 年，澳大利亞科學家在墨爾本一家醫院宣布成功培育出澳大利亞第一頭克隆豬，同年又培育了一頭克隆豬[19]，其GT 基因被成功“關閉”[19]；同年，賴良學采用基因敲除技術先培育出7 頭不帶“排斥基因”的克隆豬[20]；同年10 月，美國密蘇里大學培育出4 頭含有熒光水母基因的小豬[21]。 2002 年異種器官移植研究領域的一個重要進展是英國PPL 醫療公司培育出5 頭體內有一個基因被關閉的新型轉基因克隆豬。 2002 年4 月， 美籍華裔楊向中教授和臺灣大學教授鄭登貴成功將人類第九凝血因子及豬乳鐵蛋白基因轉入到豬體內，生產出轉基因克隆豬[23]；同年7 月，日本研究人員將豬皮細胞的核移植入未受精的卵細胞，電刺激融合，移植到子宮，成功培育出一頭雌性克隆豬[24]；同年8 月，韓國研究人員采用體細胞克隆方法生產出5 頭雌性小豬[25]。 2003 年中國臺灣的研究人員將成年豬的一個完整細胞植入一個原有遺傳物質已經被抽空的受精卵中，成功克隆出4 頭小豬。2004年7 月， 日本科學家將綠色熒光蛋白質的水母基因植入豬的體細胞中，然后通過體細胞克隆技術，生產出含有水母基因的轉基因克隆豬[25]。 2005 年中國農業大學獨立自主完成首例體細胞克隆小香豬[26]；2006 年采用體細胞克隆技術成功“克隆”出我國東北民豬[27]。2007 我國運用體細胞克隆技術，成功克隆出醫用小型豬。2008 年中國農大試驗用同一頭母豬作為移植受體克隆出健康歐洲哥廷根小型豬， 克隆效率達到了國際先進水平[28]。 2010 年魏紅江團隊運用體細胞克隆技術獲得世界第一頭版納微型豬近交系克隆豬[29]；2014 年，我國又獲得世界第一頭孤雌生殖克隆豬；2015 年我國與美方合作首次獲得了滅活了內源性逆轉錄病毒的克隆豬。2020 年四川運用體細胞克隆技術獲得23 頭克隆青峪豬[30]。

2.3 豬的克隆技術

2.3.1 卵母細胞的體外成熟、 受精和培養 豬的克隆技術主要分為四個步驟， 首先是卵母細胞的體外成熟、受精和培養。直到最近，還很難通過體外成熟、受精和培養從未成熟卵母細胞中產生豬囊胚。 最突出的障礙之一是通過體外受精獲得的正常受精卵母細胞很少。 從卵巢卵泡中解放出來的未成熟卵母細胞在培養過程中幾乎都能恢復減數分裂，達到中期。雖然成熟的卵母細胞可以通過遺精在體外滲透，但觀察到雄性原核形成率低，多精子發生率高。結果表明， 豬穿透卵母細胞雄性原核形成的失敗可歸因于卵母細胞細胞質的不完全成熟， 成熟條件得到了改善。用于豬卵母細胞成熟的培養基通常輔以血清，如胎犢血（FCS）、新生小牛血清和豬血清。 然而，據報道，FCS 抑制豬卵母細胞在添加FSH 的改良Krebs-Ringer 碳酸氫鹽溶液中的成熟， 不能改善精子體外穿透后的雄性原核形成。相反，當卵母細胞在豬濾泡液(FF)中成熟時，添加FSH 的卵母細胞在體外受精，81%穿透卵母細胞中的雄性原核表達也表明， 在改良的組織培養基-199 中添加10%FCS 或Newborn-仔豬血清似乎不利于細胞質成熟， 因為雄性原核形成低于10%PFF 或0.4%聚乙烯醇[31]。

通過控制處理精子和卵母細胞受精的培養基條件，可以降低多精子率。當精子與輸卵管細胞預孵育2.5 h 時，多精子率降低，而穿透率沒有明顯降低。此外，單在精子預孵育過程中，在mTCM-199 中加入0.4%牛血清白蛋白（BSA） 可降低多精子癥的發生率。 最近，據報道，采用改良的Tris 緩沖培養基作為受精培養基， 在不預孵化精子的情況下抑制了多精子[32]。

豬囊胚體外產生的另一個問題是受精卵的發育在4 細胞階段受阻。為了克服這種發育停滯，研究了各種因素對活體受精豬卵母細胞體外發育的影響。草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸或乳酸可作為早期卵裂期小鼠胚胎的唯一能源。 乳酸和丙酮酸通常包括在培養基中，乳酸被認為是最佳發育所必需的，然而，在豬中，乳酸抑制胚胎發育，胚胎發育不需要乳酸或丙酮酸。在沒有乳酸和丙酮酸的情況下，葡萄糖和谷氨酰胺支持胚胎發育到Morula 和囊胚階段。低?；撬峄蚺；撬岬募尤腼@著改善了體外胚胎發育。 基于這些結果，開發了一種指定的NCSU-23 培養基，用于培養豬體內受精胚胎到囊胚期。NCSU-23不僅可用于體外胚胎的培養， 還可用于未成熟卵母細胞的體外成熟。 添加透明質酸刺激胚泡形成體內受精胚胎和電活化卵母細胞或體外受精胚胎， 這些胚胎已在體外成熟。 最近， 據報道， 牛血清白蛋白(BSA)是豬胚胎發育的一個重要因素：本質上不含脂肪酸的BSA 支持發育，但V 級BSA 具有脫胎效應。此外，在晚胚乳期/早期囊胚期添加FCS 刺激囊胚孵化，盡管FCS 對發育有害，直到胚胎到達晚胚/早期囊胚期[33]。

2.3.2 核轉移 用postembryonic 基因組激活階段核重組的豬核移植胚胎的體外發育能力非常有限，到目前為止，只有一頭仔豬是由于核移植而產生的。仔豬MS 來源于單4 細胞胚體與中期LI 卵母細胞的融合，是88 個已轉移的重建胚胎之一。結果表明，豬核移植胚胎由8 至16 個細胞期核重組，成熟卵母細胞在體外裂解的速率為36%～43%， 但Morula 期以外的發育速率僅為4.5%～7%。 最近報告，28%的核移植胚胎與Morula 期細胞核重組，15%發育形成囊胚，采用預激活卵母細胞作為受體細胞，并在電激活后6 h 誘導囊胚與細胞融合， 去除細胞質脂后冷凍保存。

2.3.3 胚胎移植 目前， 仔豬尚未通過體外從未成熟卵母細胞中產生的囊胚轉移獲得。 當從體內或體外受精卵母細胞體外發育的囊胚被轉移到受體雌性中時， 從體內受精卵母細胞中獲得的胚胎會產生后代， 但從體外受精卵母細胞中獲得的胚胎的轉移并不會導致懷孕。 另一方面，研究表明，體外成熟的胚胎和受精的卵母細胞在2 細胞階段轉移到受體時，可以發育成仔豬。 這些結果表明，如果體外成熟、受精和培養的任何系統都不完整，卵母細胞/胚胎的活力在所有階段都會受到影響[34]。 當采用體外成熟/受精或體外培養時，胚胎可以在移植后發育成仔豬，因為損傷量相對較小。 然而，通過體外成熟、受精和培養產生的胚胎損傷是廣泛的，它們不會發育到后代。

2.3.4 孵化囊胚 孵化的囊胚衍生細胞與體外成熟卵母細胞融合。一般來說，由平行絲組成的腔室已被用于融合， 但該腔室不適合融合孵化的囊胚衍生細胞和去核卵母細胞。 相反，當細胞-卵母細胞復合物被夾在排列在一條直線上的電線之間時， 融合胚胎的百分比很高（未公布的數據）。 在體外培養重建胚胎時，其中一些胚胎被切割并發育到囊胚階段。在進一步進行的試驗中， 重建的胚胎被轉移到受體實體中，以檢查它們發育成后代的能力[35]。

4 存在的問題與不足

雖然豬克隆的意義深遠， 但其應用研究進展相對緩慢，相關技術仍很不完善。 比如體外受精，體外培養體系和體外成熟技術還很不成熟， 核分離和卵母細胞去核化水平也有待提高。 因為基礎理論研究在我國相對薄弱， 對一些早期胚胎發生和發育機制缺乏深入了解，此外，對一些基因組重編程的機制尚不清楚， 對核移植后基因組重編程的影響也有待進一步闡明。盡管困難和問題較多，但是作為種質資源擴繁和異種移植的巨大前景， 仍將激勵更多的投入和付出。 總之，豬克隆技術將得到進一 步改進和發展，基礎研究和生產實踐的應用將更加廣泛。

5 結 論

克隆豬的生產系統不僅對于提高優勢動物的產量非常重要， 而且對于生產具有不含異種移植抗原器官的Imockout 動物，或分析分離的人類基因的功能也非常重要，但有效的系統尚未開發。一個突出的障礙是缺乏支持這項研究所需的基本技術信息，這些基本技術需要發展到一個令人滿意的水平， 然后才能開發克隆豬的生產系統。