T13納濾膜通量與聚體含量相關性的初步研究

胡偉偉 謝一龍 蘇賢德 陸建勝通訊作者）

正大天晴藥業集團南京順欣制藥有限公司 江蘇南京 210000

用哺乳動物細胞培養來生產的生物制品，病毒污染風險是一個主要的安全問題。為了確保產品的安全，監管機構需要生產商證明生產產品的工藝有足夠的病毒去除能力，并在生產過程監控納濾載量不超過病毒驗證的載量[1-4]。

除病毒過濾通過分子排阻原理實現去除病毒，作為一種能夠高效去除病毒的方法，廣泛用于治療性蛋白藥物下游純化工藝。由于納濾膜成本高且一次性使用，因此迫切需要通過獲得最高的過濾膜載量，降低納濾工藝成本。因此，從安全性、成本以及法規監管的角度出發，設計一個既能滿足高通量，又能高效的病毒的工藝至關重要[5]。

在中試室放大生產過程中發現，T1320150401批次1000L規模純化時，納濾過程中出現通量快速衰減、納濾膜堵塞的現象，導致膜通量急聚下降，為了保持納濾工藝的穩定性，通過納濾小試的分析，確定影響通量的限制性因素。

1 實驗材料和實驗方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

T1320150401批次原液樣品，SEC主峰含量96.5%，濃度25.6g/L。

1.1.2 試劑和耗材

配置緩沖液的試劑均為化學純，購自南京晚晴化玻儀器有限公司；納濾膜Viresolve Pro（面積3.1cm2）、Viresolve Pro Modus1.2（面 積0.07m2）、Viresolve Pro Modus1.3（面 積0.22m2），攔截尺寸為20nm（病毒顆粒大于20nm，蛋白分子為10-15nm），均購于Merck Millipore。

1.1.3 儀器

層析系統為?KTA Purifier、?KTA Process購自GE公司；UV-1200紫外分光光度計購自上海美普達，電子天平（精度0.01，量程大于500g）購于梅特勒。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同純度樣品的制備

T1320150401批次原液通過陽離子層析精制兩個純度樣品，樣品一：SEC純度98.0%，聚合物1.92%，編號為NF-1；樣品二：SEC純度97.5%，聚合物2.43%，編號為NF-2；樣品三：對T1320150401批次原液樣品用陽離子洗脫液進行換液，得到SEC純度為96.0%，聚合物為3.99%，編號為NF-3。

1.2.2 納濾的原理和步驟

本試驗采用Vmax 法，對料液進行試驗。Vmax試驗即恒壓試驗，即在恒定壓力下使料液通過過濾器，并在一定時間間隔記錄濾液體積；是一種加速試驗，基本原理是依據濾膜逐漸堵塞模型方程，可以預知濾器的最大負載和流量衰減，從而進行過濾器的選型放大，適用于所有表面過濾和膜過濾器。

1.2.2.1 納濾工藝條件

恒壓30psi，樣品濃度10g/L，納濾時間2小時（備注：實驗設計的溫度和緩沖液均相同）。

1.2.2.2 納濾操作流程

安裝Vmax 系統（壓力罐、壓力表、帶閥門的出口、壓縮空氣入口、除病毒過濾器，天平或量筒）。

連接壓縮空氣到壓力罐，調節壓力至試驗壓力并檢查有無泄漏，然后釋放壓力。

連接所需測試的過濾器，需事先潤濕膜片，在濾器下游安裝閥門便于上游排氣。

關閉濾器上、下游閥門，在壓力罐中裝入料液，調節壓力至設定壓力。

打開濾器上游閥門，潤濕濾器；然后打開排氣口閥門充分排出空氣。

在潤濕和排氣后，打開下游閥門，當第一滴料液進入收集容器時開始秒表計時。

濾液收集在燒杯或其它合適的容器中。

在適當時間間隔測定濾液體積（通?？梢詼y定重量進行轉換），持續120分鐘。

2 實驗結果

2.1 樣品聚體含量對納濾的影響--Scale-down

按照實驗設計通過Scale-down方式按照1.2.2的實驗方法完成不同聚體含量對納濾膜包載量的影響實驗。

2.1.1 樣品聚體含量對過濾通量的影響

圖1 樣品過濾量和過濾瞬時通量過程變化曲線

由圖1可知，在2小時的過濾時間內，隨著樣品聚體的增加，納濾的過濾量明顯降低，其中NF-1的過濾量是NF-2的1.36倍。由過濾瞬時通量曲線可知，隨著樣品聚體的增加，通量衰減的越快，其中NF-1過濾瞬時通量曲線緩慢衰減，2小時后瞬時通量為起始的84.8%；NF-2過濾瞬時通量曲線衰減較快，2小時后瞬時通量為起始的40.2%；NF-3過濾30分鐘后，瞬時通量衰減至0，共過濾12.9mL樣品。

2.1.2納濾前后對樣品聚體含量的影響

圖2 樣品納濾前后聚合物含量的變化

為了進一步探究不同聚體含量樣品通量衰減差異的原因，檢測了納濾前后聚體含量。結果表明：聚體能夠被截留，并不同程度堵塞納濾膜。由圖2結果可知，隨著過濾前樣品的聚體含量越高，過濾后樣品的聚體降低幅度越大。樣品NF-2和NF-1相比，納濾前后聚體含量有下降趨勢，說明部分聚體被納濾膜截留，導致過濾樣品的體積減少40mL以及瞬時通量衰減的更快；樣品NF-3，納濾前后聚體含量下降很明顯，大量聚體被截留，導致納濾膜30分鐘就被完全堵死。

2.1.3 樣品聚體含量對納濾膜載量的影響

圖3 不同樣品純度的納濾膜載量

納濾膜載量作為納濾膜面積選型的重要依據，由圖1的結果計算出不同聚體含量樣品對應的過濾膜載量。由圖3可知，隨著樣品聚體含量的增加，納濾膜載量急劇下降。

T1320150401批次1000L規模的純化，納濾工藝放大時，樣品的純度為96.5%，過濾30g的樣品后，瞬時過濾通量衰減至0，此時納濾膜載量為0.43kg/m2，和樣品NF-3實驗的載量和瞬時過濾通量衰減趨勢一致。

目前，中試車間納濾工藝的成本很高，占下游純化總成本30-40%，因此需要建立中控指標，確保納濾工藝的順利進行?；诩{濾通過分子大小進行孔徑截留，確定聚體含量作為該工藝前的CQA指標。結合納濾小試結果和上游細胞培養的產品質量，可以初步內控納濾前樣品的聚體含量不超過2.0%，通過工藝放大來進行確認。

2.2 聚體含量對納濾膜通量的影響確認—Scale-up

圖4 納濾過程示意圖

按照圖4的裝置圖，進行T13201512021000L的納濾工藝放大，樣品的過濾濃度為10g/L，納濾膜面積0.22m2，使用30psi恒定壓力過濾，記錄過濾的瞬時流速并轉化為瞬時通量（LMH），繪制成瞬時通量隨時間的變化曲線（圖5）。

由圖5可知，隨著納濾的進行，納濾的瞬時通量逐漸降低，過濾2小時，過濾瞬時通量降為初始的36.3%；由圖2可知納濾前后樣品的聚合物含量基本維持不變，說明納濾膜基本沒有截留聚合物；同時，在2小時內過濾810g蛋白/0.22m2，超過病毒驗證時的704g蛋白/0.22m2的上限，說明納濾工藝放大成功。

圖5 納濾通量隨時間的變化關系曲線

2.3 納濾工藝：小試和放大至生產規模的差異分析

由圖1的NF1和5瞬時通量曲線可知，小試和放大時的瞬時通量并未做到線性放大，主要由于膜包的規格型號差異以及設備系統差異造成；由圖3表明，小試和放大的質量載量并非隨著聚體含量的增加線性降低，當聚合物含量在3.5%以上時，容易堵塞納濾膜，導致載量極低，代表了樣品的一種最差條件，在大生產時應建立中控限度來避免；納濾工藝在放大時并非單因素的線性放大，與產品的純度、樣品的溫度、粒徑分布、濃度、凍融情況以及放大用膜包和小試膜規格型號不一致等因素有關；根據供應商的建議，在大生產納濾膜面積的確定需要乘以1.2-1.5的安全系數，來減少批次間的差異對膜工藝選擇的干擾，確保納濾工藝的穩定進行。由小試和放大至生產規模的差異分析，小試研究聚體含量對膜通量影響能夠確定樣品的最差條件，同時能夠確定聚合物含量對膜載量的變化趨勢，由于大生產時納濾工藝的成本高，納濾工藝放大前需要確定中控指標，確定過濾前樣品聚體含量和膜的質量載量，為后續2000L大生產提供納濾膜面積的選型和中控CQA限度。

基于T131000L規模放大的納濾工藝參數以及納濾病毒驗證的結果，建議2000L規模放大的納濾膜面積1.15-1.43m2，納濾前樣品聚體不高于2%。（備注：建議膜面積=膜載量＊安全系數；2000L規模細胞培養工作體積1700L，表達量2.0g/L，當工藝放大膜載量大于VC載量時，以VC載量作為膜面積選型的載量）

3 結語

樣品的聚體含量對納濾通量有著重要的影響，當樣品聚體大于3.5%時，過濾樣品時很容易堵塞納濾膜，膜載量很低；當樣品聚體小于2%時，過濾前后樣品聚體含量基本不變，聚體不會被納濾膜截留，此時聚體含量對納濾工藝的影響會降低，分別進行了兩批1000L工藝的放大驗證了小試的結論。

SEC純度對納濾工藝的影響并非線性的，本文的研究內容針對抗體藥物可能具有通用性，后續研究會繼續關注?；诩{濾小試和放大的差異，建議每個項目做一次生產規模的工藝放大；為了保證納濾工藝的穩定放大，需要建立關鍵的中控參數，比如樣品SEC純度、粒徑分布等。