小膠質細胞參與新生兒缺氧缺血性腦損傷所致突觸異常的研究*

閔穎俊， 趙俊雄， 彭 行， 曾祥菲， 顏 琳， 華海蓉，毛榕榕， 金會艷， 李 凡△

（昆明醫科大學 1病理學與病理生理學系，2臨床醫學系，3基礎醫學實驗教學中心機能學實驗室，云南昆明650500）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是導致兒童神經系統傷殘的常見原因之一。近年來新生兒重癥醫學發展迅速，HIBD 患兒存活率顯著提高，但幸存患兒因HIBD 所致腦損傷卻依然存在，包括腦癱、癲癇、認知功能障礙等[1-3]，嚴重影響患者的生活質量，給家庭和社會帶來極為沉重的負擔。腦損傷發生后，可直接因缺氧缺血導致神經元受損、突觸異常增多或者減少，也可因缺氧缺血激活免疫系統，間接導致神經系統出現異常的突觸修剪，進而導致患者出現認知障礙[4]。

小膠質細胞（microglia，MG）作為腦內主要的免疫細胞，在生理情況下通過釋放活性氧和細胞因子，清除凋亡的細胞碎片，同時受到補體CR3 及C1q 的調控，在發育腦內可以影響突觸數量，發揮突觸修剪作用，對維持中樞神經系統內環境穩定及形成神經環路尤為重要[5-8]。MG 活化是HIBD 的核心發病機制之一，當腦內由于缺氧、缺血、炎癥等原因發生病理改變時，MG 將被激活，表現為數量增多和功能活躍，過度激活的MG 在清除死亡細胞碎片的同時，也可產生大量炎癥因子，造成神經毒性作用，損傷中樞神經系統的正常細胞，造成神經元損傷及突觸結構和功能破壞。目前的研究認為發育腦內MG 與外周血單核細胞源性巨噬細胞（monocyte-derived macrophage，MDMs）共存，二者可共享傳統意義上MG 的標志物CD11b[9]，這提示腦內CD11b+細胞的變化并不能完全代表腦內駐留MG 的變化。然而目前對于這兩種細胞是否均參與了HIBD 后腦內的吞噬活動，是否均影響HIBD 后突觸蛋白清除的過程尚不清楚。有研究報導CX3CR1 在腦內僅表達于MG[10]，常被用于腦內駐留MG 的特異性標志物[11]。為研究腦內駐留巨噬細胞-MG 在HIBD 后對突觸的作用，本研究利用CX3CR1GFP小鼠構建HIBD模型，試圖揭示MG通過吞噬參與HIBD后突觸異常可能的作用機制。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 用于本實驗的C57BL/6J小鼠，動物許可證編號為SCXK（滇）2015-0002，由昆明醫科大學動物實驗學部提供及飼養。CX3CR1GFP小鼠購自Jackson Laboratory（No.005582），幼鼠6～10只與母鼠同籠飼養，保證食物及水供應，光照時間為7：00～19：00。對實驗動物的飼養及處理，均遵守國際醫學科學組織理事會制定的國際動物研究指導原則（1985），旨在減少實驗動物的數量并減輕其痛苦。

1.2 實驗材料 吸入用七氟烷（喜保福寧，進口藥品注冊證號為H20150020，日本丸石制藥株式會社）；水合氯醛（Solarbio，Cat：T8590）；氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC；Sigma，Cat：93140）；多聚甲醛（天津市瑞金特化學品有限公司）；溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1；Novus，Cat：NB120-19294）；髓系細胞觸發受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2；Millipore，Cat：MABN755）；神經元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN；Millipore，Cat：ABN90）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Dojindo，Cat：D212）；突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95；CST，Cat：36233）；突觸蛋白（synapsin，SYP；CST，Cat：9020）；熒光II 抗購自Life；Fluoro-Jade B（FJB）染液（Merck Millipore，Cat：AG310）；Western blot 用II 抗購自博奧森公司。石蠟切片機（Leica，型號：RM2235）；正置顯微鏡（Olympus，型號：BX53）；冰凍切片機（Leica，型號：CM1950）；熒光共聚焦顯微鏡（Nikon，型號：A1）。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立 本研究采用同窩出生的9～11日齡C57BL/6J及CX3CR1GFP小鼠幼崽，通過改良的Rice-Vannucci 法建立HIBD 模型[12]，操作步驟如下。實驗動物隨機分為缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI）組和同齡對照（control，Con）組。HI組通過七氟烷吸入麻醉（每只30 μL）仰臥位固定四肢，在一種小型實驗動物手術箱（專利號：ZL 201520214776.3）中進行左側頸總動脈結扎手術，術后將動物放回母鼠身邊休息1.5 h，休息結束，放入一種改進的恒溫缺氧模型實驗裝置（專利號：ZL 201320101770.6）中，保持溫度為34.0℃～34.5℃，在8% O2+92% N2下暴露45 min。Con組無缺氧處理，其余條件與HI組一致。

2.2 TTC 染色 取造模后3 d 小鼠及同齡對照組小鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后取腦組織，腦組織置于-20℃冰箱中冰凍10～15 min，待腦組織變硬后進行切片，腦組織由前額至小腦切成6 片，切片厚度為1 mm，切好的腦片放入提前預熱到37℃的1%TTC 染液中，避光水浴約15 min，染色結束后，將腦片置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜后拍照。

2.3 體重稱量 于小鼠結扎頸總動脈造模當天（術前）至HI 后3 d，每天晚上19 點稱量各組別小鼠體重，記錄每天體重變化情況，并繪制體重增長曲線，觀察C組及HI組的體重增長情況。

2.4 抓握實驗[13]將HI 后1～3 d 的小鼠及同齡對照小鼠的前爪搭置在細鐵絲上，觀察小鼠運動功能協調性。評分標準：跌落為0 分；一只或兩只前爪緊緊抓住細鐵絲為1 分；試圖爬上鐵絲為2 分；一只或兩只前爪和一只或兩只后爪緊緊抓住細鐵絲為3分；前爪和后爪緊緊抓住細鐵絲和尾巴纏繞鐵絲為4分；逃跑為5分。

2.5 懸吊實驗[14]將HI 后1～3 d 的小鼠及同齡對照小鼠的兩只前爪緊緊抓住離地面高度為45 cm 的細鐵絲，記錄小鼠懸吊在細鐵絲上的時間。評分標準：1 分≤10 s；2 分≤11～30 s；3 分：31 s～2 min；4分：3～5 min；5分＞5 min。

2.6 HE 染色及Fluoro-Jade B（FJB）染色 取HI 后3 d的小鼠及同齡對照組小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，經4%多聚甲醛溶液灌流后取腦組織，浸入10%甲醛溶液中固定7 d，經梯度乙醇脫水、浸蠟包埋成蠟塊，切片后進行常規HE 染色（晾干后正置顯微鏡下觀察）或FJB 染色（晾干后熒光顯微鏡下觀察）。

2.7 Western blot 檢測目標蛋白水平 取HI 后3 d的小鼠及同齡對照組小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速分離腦組織，取出皮層，放入預冷的1.5 mL EP 管內，根據組織重量，加入裂解液，進行研磨，并4℃離心，收集蛋白上清液，經BCA 測定濃度后，每組取處理好的蛋白樣品20 μg（10 μL）進行電泳，并將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上。待轉膜結束后，使用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入相應的I抗，室溫孵育1 h，4℃過夜。第2 天加入含有辣根過氧化物酶的II 抗，室溫孵育2 h。經Bio-Rad Chemi-Doc XRS+顯影系統掃描后，用ImageJ 6.0 軟件測量目標蛋白及內參照的灰度值。

2.8 免疫熒光染色 取HI 后3 d 的小鼠及同齡對照組小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經2%多聚甲醛溶液灌流后取腦組織，浸入2%多聚甲醛溶液中固定，4℃過夜，先后經15%及30%蔗糖脫水沉底，用液氮速凍組織樣本，保存在-20℃冰箱備用，利用冰凍切片機切片后進行免疫熒光化學染色，具體步驟如下：-20℃拿出玻片，室溫晾干→免疫組化筆畫圈→PBS-T 洗10 min×3 次→5%驢血清室溫封閉2 h→滴加Ⅰ抗，4℃過夜→PBS 洗10 min×3 次→滴加相應的Ⅱ抗，室溫1 h→PBS 洗10 min×3次→滴加DAPI工作液，室溫3 min→PBS 洗10 min×3 次→熒光抗淬滅劑封片，4℃保存，激光共聚焦顯微鏡觀察。

3 統計學處理

使用GraphPad Prism 6 軟件進行統計分析。所有數據表示為均數±標準誤（mean±SEM）。對各組數據進行正態性和方差齊性檢驗，若數據呈正態分布，則采用兩獨立樣本t檢驗；若數據不符合正態分布，則采用Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 HIBD后小鼠腦組織病理形態學、體重及行為學的變化

造模后3 d，取小鼠腦組織進行TTC 染色，對照組腦組織切片均勻紅染，HI 組腦組織于損傷同側出現明顯液化壞死灶（圖1A，黃色虛線條所示區域）。小鼠用4%多聚甲醛經左心室穿刺灌流后，觀察大腦大體形態，對照組可見兩側大腦半球大小均等，呈淡黃色；HI 組可見損傷同側大腦半球有呈白色的壞死灶（圖1B，黃色虛線條所示區域）。HE染色結果則顯示，HIBD 后3 d，腦皮層及海馬CA2 區質地疏松、染色變淺，神經元胞體變小，核深染，出現核固縮、核碎裂、核溶解等現象（圖1C 中綠色箭頭所示），提示復制模型成功。隨后我們觀察了HIBD術前至HIBD后3 d小鼠及同齡對照組小鼠的體重變化：造模當天HI組小鼠及同齡對照組小鼠術前體重差異無統計學顯著性，但HIBD 后1～3 d 的HI 組小鼠體重顯著低于同齡對照組小鼠（圖1D），其抓握實驗評分也顯著低于同齡對照組小鼠（圖1E）。在懸吊實驗中，HIBD 后1 d 的HI 組小鼠懸吊實驗評分顯著低于同齡對照組小鼠，HIBD 后2 d 及3 d 的HI 組小鼠懸吊實驗評分與同齡對照組相比雖有所降低，但差異無統計學顯著性（圖1F）。

2 HIBD后神經元損傷及突觸蛋白異常表達

造模后3 d，取小鼠腦組織進行FJB染色，對照組腦組織切片未見陽性細胞，HI 組腦組織于損傷同側皮層及海馬出現陽性細胞，表明HIBD 后皮層及海馬存在壞死神經元（圖2A，黃色箭頭所示）。小鼠腦皮層的Western blot 結果顯示，HIBD 后3 d 腦皮層神經元的NeuN 表達較同齡對照組明顯下降，這進一步證實HIBD 后腦內神經元受損（圖2B）。免疫熒光染色也顯示，HIBD 后3 d 腦皮層神經元細胞核的標志蛋白NeuN 表達下降（圖2C，白色箭頭所示），均提示HIBD 后神經元損傷。神經元受損后往往伴隨有突觸蛋白的表達異常，因此我們進一步研究了HIBD 后腦內突觸蛋白的表達情況，發現HIBD 后3 d，與同齡對照組小鼠相比，腦皮層區域，突觸后膜蛋白PSD95的表達出現增加，并且聚集在梗死灶邊緣區域（圖2D，白色虛線為梗死區域，白色箭頭所示為增多的突觸后膜蛋白），提示HIBD 后腦內突觸后膜蛋白異常增加；Western blot的結果也顯示，HIBD 后腦皮層內突觸后膜蛋白PSD95的表達增多（圖2E）。

Figure 1. Pathomorphological changes of brain tissue，body weight and behavioral changes of the mice after HIBD. A：TTC staining of the brain tissue at 3 d after HIBD；B：the gross morphology of the brain at 3 d after HIBD；C：HE staining of the brain tissue at 3 d after HIBD；D：the body weight of the mice after HIBD；E：the grip test score of the mice after HIBD；F：the hanging test score of the mice after HIBD. Con：control mice of the same age；HI：hypoxic-ischemic mice. Mean±SEM. n=3-26. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Con group.圖1 HIBD后小鼠腦組織病理形態學、體重及行為學變化

3 HIBD后腦內皮層吞噬蛋白增加

本研究進一步通過對HIBD 后3 d的小鼠腦組織進行Western blot 檢測，結果顯示，與同齡對照組小鼠相比，HIBD 后3 d 小鼠腦皮層吞噬相關蛋白TREM2 和LAMP1 表達均增加（P＜0.05 或P＜0.01），提示HIBD后腦皮層內吞噬蛋白表達增加，見圖3。

4 HIBD 后腦內髓系細胞——CD11b+細胞吞噬功能的變化

神經元損傷及突觸蛋白的異常表達必然破壞腦內環境的穩定，激活免疫系統，MG 作為腦內重要的免疫細胞，在生理及病理情況下都有強大的吞噬能力。為了進一步確定HIBD 后腦內髓系細胞——CD11b+細胞的吞噬能力變化，我們通過免疫熒光多重標記染色發現，HIBD 后3 d，HI 組梗死灶邊緣及中心區CD11b+細胞（紅色）數量明顯增多，部分與神經元標志物NeuN（綠色）及LAMP1（青色）共染（圖4，白色箭頭所示），部分未與LAMP1 共染（圖4，黃色箭頭所示），提示HIBD 后腦內部分CD11b+細胞出現吞噬神經元的現象。

5 HIBD 后腦內駐留巨噬細胞——MG 參與吞噬突觸

為進一步確認MG是否參與了吞噬突觸的過程，本研究利用MG 被特異性標記了綠色熒光的小鼠——CX3CR1GFP轉基因小鼠建立HIBD 模型，通過免疫熒光共聚焦掃描發現，HIBD 后3 d，腦內MG 數量增多，胞體變圓，且TREM2 表達增加（圖5A，白色箭頭所示），提示HIBD 后MG 活躍，吞噬能力增加。為進一步確認MG是否參與了吞噬突觸，本研究進一步觀察了HIBD 后MG 胞內SYP 的變化，結果表明，HIBD 后3 d，MG 胞內出現了SYP 的表達（圖5B，黃色箭頭所示），提示HIBD后MG參與了突觸吞噬。

Figure 2. Neuronal injury and increase in postsynaptic membrane protein after HIBD. A：Fluoro-Jade B（FJB）staining of cerebral cortex and hippocampal CA2 region in mice at 3 d after HIBD；B：the expression of NeuN in the cerebral cortex of mice detected by Western blot at 3 d after HIBD；C：the NeuN immunofluorescence staining results in the brain at 3 d after HIBD；D：the immunofluorescence staining results of brain postsynaptic membrane protein PSD95 at 3 d after HIBD；H：the expression of PSD95 in the cerebral cortex of mice detected by Western blot at 3 d after HIBD. Con：control mice of the same age；HI：hypoxic-ischemic mice. Mean±SEM. n=3-5. *P＜0.05 vs Con group.圖2 HIBD后神經元損傷及突觸后膜蛋白增多

Figure 3. Increased expression of cortical phagocytic protein after HIBD. A：the expression of phagocytosis-related molecule TREM2 in cortex of mice detected by Western blot at 3 d after HIBD；B：the expression of phagocytosis-related molecule LAMP1 in cortex of mice detected by Western blot at 3 d after HIBD. Con：control mice of the same age；HI：hypoxic-ischemic mice.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs C group.圖3 HIBD后腦皮層吞噬蛋白表達增多

Figure 4. Changes of macrophage phagocytosis in the brain after HIBD. The immunofluorescence staining results of neurons，macrophages and phagocytosis-related proteins in the brain of mice at 3 d after HIBD were shown（scale bar=100 μm in A and B；scale bar=20 μm in C，D and E）. A and C：control group；B，D and E：HIBD group. Part of CD11b+cells（red）were costained with neurons（green）and LAMP1（cyan），as shown by the white arrows in D and E. The yellow arrow showed that some CD11b+cells（red）were not co-stained with LAMP1（cyan）. Blue represented DAPI.圖4 HIBD后腦內巨噬細胞吞噬情況變化

討論

HIBD 是導致新生兒死亡以及患兒遠期行為出現異常的主要原因之一，遠期行為異常與神經元丟失、突觸數量與結構變化密切相關。MG 作為腦內最為重要的固有免疫細胞[15]，除通過釋放炎癥因子參與腦損傷后的神經炎癥反應外，還可通過吞噬作用清除腦內的細胞碎片及軸突碎片參與維持內環境穩定。HIBD后突觸損傷的方式及MG對突觸蛋白的吞噬作用尚未見報道。本模型的受損區域主要為皮層及海馬神經元，伴隨著MG 的活化，其吞噬功能的改變，清除腦內細胞碎片與軸突碎片的同時，過度活化的MG 也有可能損傷正常神經元。突觸作為神經元的基本結構單位，是學習和記憶的基礎，神經元的損傷往往會導致突觸數量和結構的變化，引起患兒出現學習障礙和行為異常。因此深入研究HIBD 后神經元和突觸的變化，了解MG 的吞噬功能改變，尤其是對其吞噬突觸的作用，對于了解HI 后MG 在腦損傷過程中發揮的作用尤為重要，并可為臨床治療HIBD患兒提供潛在的治療靶點。

神經元及其突觸是維系行為正常的必要基礎，本研究首先證實了HIBD 造成的行為異常及突觸丟失情況。結果揭示HIBD 后小鼠體重出現明顯下降，HIBD 后1～3 d 小鼠抓握實驗評分出現明顯下降，而懸吊實驗則僅在HIBD 后1 d 出現評分下降，提示小鼠在HIBD 后出現了行為異常。HE染色發現，HIBD后小鼠腦皮層及海馬區域神經元出現壞死典型的病理改變，與多數人的研究一致[12，16]。我們進而通過Western blot、FJB 染色及免疫熒光染色揭示，HIBD后壞死神經元數量明顯增多，正常神經元數量明顯低于同齡對照組，表明HIBD 后3 d 小鼠腦內出現了明顯的神經損傷。神經元胞體的受損往往伴隨有其突起（軸突及樹突）的損傷[13]，軸突及樹突是形成神經突觸的重要結構，突觸又是信息傳遞的基礎，對于構建大腦內精確的神經環路尤為重要，有研究報道低氧可以誘導海馬CA1神經元樹突棘形態結構發生變化，最終影響其學習和記憶[14]。這些結果表明，HIBD后出現了突觸的丟失。

構成突觸的蛋白主要包括突觸前膜及突觸后膜蛋白，突觸蛋白的表達與突觸損傷未必一致。2019年Griffiths 等[17]的研究發現外傷性腦損傷后，突觸后膜蛋白表達增多，也與癲癇模型海馬損傷后模型相似[18]。還有研究報道在低沖擊爆炸所致的腦損傷模型中，腦皮層突觸數量的減少伴隨有突觸蛋白厚度增加，而海馬則相反，提示損傷后腦內發生了潛在的突觸重構[13]。本研究的結果表明HIBD 后大腦皮層內突觸后膜蛋白PSD95 的表達明顯增多，增多的PSD95 蓄積在梗死灶的邊緣區域，可見HIBD 后突觸的損傷形式為突觸的直接丟失及突觸后膜蛋白PSD95 的過表達，其如何參與突觸重構的機制還有待進一步研究。

我們還探討了HIBD 后腦內駐留巨噬細胞MG的吞噬作用是否參與HIBD 后突觸損傷及其可能的作用機制。LAMP1表達增加往往意味著細胞吞噬活動增強[19]。TREM2 則是參與調控MG 吞噬的主要分子，但其在HIBD 中的作用未見報道。本研究的結果顯示，HIBD 后3 d 皮層吞噬相關蛋白LAMP1 及TREM2 表達明顯增多；免疫熒光共定位結果顯示，HIBD 后3 d 梗死灶邊緣區域LAMP1 的表達增加，但并不完全表達在CD11b+細胞內，且此區域NeuN的表達仍呈現下降，同時部分溶酶體活躍的CD11b+細胞出現吞噬神經元的現象。這些結果提示，HIBD 后，尤其重度損傷組腦內CD11b+細胞具有活躍的吞噬功能，并與HIBD后神經元突觸的丟失有關。

近年來，大量研究證實腦損傷后腦內CD11b+細胞可以分為來自于外周入侵的單核細胞及來自于中樞的MG 兩群細胞[20-22]，提示腦內CD11b+細胞的變化并不能完全代表腦內駐留MG的改變。因此，為了進一步確定HIBD 后腦內MG 的吞噬能力變化及其與突觸的關系，本研究通過CX3CR1GFP轉基因小鼠構建了HIBD 模型。結果發現，HIBD 后3 d 腦內MG（綠色熒光）胞內TREM2 表達較對照組增多，提示HIBD后腦內MG 吞噬能力增加，這與Fisch 等[23]及諶貝貝等[24]的研究一致。正常發育腦內，MG 通過吞噬作用參與突觸修剪幫助建立精確的神經環路。HIBD后MG 的吞噬功能異常活躍，是否會影響其突觸修剪，導致患者出現行為異常？本研究證實，HIBD 后3 d 的MG 胞內出現更多的突觸前膜蛋白，這證明了HIBD 后MG 直接參與吞噬突觸，這將影響神經元突觸結構。2017年Aono等[25]在帕金森病中發現MG 吞噬丘腦底核谷氨酸能突觸，但HIBD 后MG 吞噬突觸的研究未見報道。因此，本研究證實了HIBD 后腦內駐留巨噬細胞MG 吞噬功能激活，并通過TREM2 上調吞噬功能，介導突觸異常，進而在HIBD 后的行為異常中發揮作用。但MG 吞噬完整突觸的方式和相關信號通路，及其可能的干預策略還有待進一步研究。