青藤堿調控CUMS抑郁大鼠突觸可塑性及其對Notch和mTOR信號通路的影響*

王志堅， 王曉敏， 劉勝兵， 郭燕君， 潘巍巍， 沈忠飛

（嘉興學院醫學院，浙江嘉興314000）

抑郁癥是一種多因素導致的復雜的精神疾病，主要表現為思維認知障礙、情緒低迷和自殺傾向等，全球約11%的人患有抑郁癥，給患者、家人和社會造成了巨大的精神和經濟負擔，嚴重阻礙了社會的發展。大量研究表明，抑郁癥是一種炎癥性疾病[1]，炎癥因子在抑郁癥的發病進程中起到重要作用，已成為抑郁癥的重要治療靶點和研究熱點。近年來，國家大力支持中醫藥發展，尤其是在此次新冠肺炎疫情的預防和治療中，中醫藥表現出良好的效果，開發新的中醫藥抗抑郁藥物是一項響應國家號召的緊迫任務。

青藤堿（sinomenine，Sin），是一種來源于中草藥防己科植物青藤的生物堿，臨床上廣泛用于系膜增生性腎炎和類風濕性關節炎治療[2]，另外Sin 還有抗腫瘤、細胞保護、免疫抑制和抗炎作用[3]。近年來研究表明，Sin 對神經疾病具有一定的作用，可通過提高腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達緩解抑郁癥狀[4]，亦能通過抑制神經炎癥減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[5]，但其對抑郁癥炎癥反應影響的研究比較少。

本實驗室前期研究顯示，30、50 和100 mg·kg-1·d-1的Sin 均能夠緩解慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠的抑郁癥狀，減輕炎癥反應，且在30 mg·kg-1·d-1的低劑量灌胃處理就有著較好的效果，但對突觸可塑性、細胞凋亡、Notch 信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路等的影響尚不明確。本研究旨在探討Sin 對CUMS抑郁大鼠突觸可塑性的影響及可能的分子機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康雄性清潔級7 周齡SD 大鼠120 只，體重180～210 g，從浙江大學實驗動物中心購買，許可證號為SYXK（浙）2018-0016。

1.2 試劑和主要儀器 兔抗Bcl-2、cleaved caspase-3（C-C3）、β-actin、BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、mTOR、磷 酸 化mTOR（phosphorylated mTOR，pmTOR）、真核細胞翻譯起始因子4E 結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）和磷酸化4EBP1（phosphorylated 4EBP1，p-4EBP1）抗體及山羊抗兔Ⅱ抗（Cell Signaling Technology）；氟西汀（fluoxetine，Fluo；禮來制藥有限公司）；Sin（Sigma）；高爾基染色試劑盒（FD Neuro Technologies）。熒光定量PCR 儀（AFD4800）；凝膠電泳儀（Bio-Rad）；動物行為自動跟蹤系統EthoVision 3.0（Noldus）；其他試劑來自碧云天生物技術有限公司。

2 方法

2.1 分組和建模 大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為對照（control，Ctrl）組、CUMS 組、Fluo 組和Sin 組（n=30），均單籠飼養。飼養環境：12 h 光照/12 h 黑暗（光照時間：早7 點到晚7 點），濕度（55±5）%，溫度（22±2）℃，自由進食進水。對照組正常飼養，其余3組采用孤養法并結合CUMS 建立CUMS 抑郁模型[6]，按表1，每天給予一種刺激，其中連續2 天的刺激不相同，合計刺激28 d。

2.2 給藥 連續刺激2 周后，將Fluo 和Sin 溶于生理鹽水中，開始對Fluo 組和Sin 組大鼠分別給予Fluo（20 mg·kg-1·d-1）[6]和Sin（30 mg·kg-1·d-1）[5]灌胃治療，Ctrl 組和CUMS 組均灌胃相同體積的生理鹽水。連續灌胃2周時間。

2.3 行為學測試 （1）體重：建模結束后分別稱量各組大鼠體重，記錄并制作柱狀圖。（2）糖水測試：建模結束后，事先給與各組大鼠2 瓶1%糖水，進行適應訓練；禁水12 h 后，準備2 瓶水，重量相同，分別編號A 和B，A 為1%糖水，B 為平時喝的水，1 h 后稱量記錄A 和B 重量。糖水偏好（%）=A 減少克數/（A+B減少克數）×100%。（3）曠場實驗：建模后，根據曠場實驗步驟[7]，記錄分析各組大鼠在格子里面的移動總距離和中央活動時間，每只大鼠測試前均應清理干凈曠場區域，以免產生干擾。（4）強迫游泳：參照文獻進行[5]，記錄大鼠游泳6 min 中后4 min 的不動時間，即頭部不能進入水中，直立姿勢漂浮的時間。

表1 溫和刺激名稱及刺激時間Table 1. The name of each mild stimulus and stimulating time

2.4 RNA 提取及qPCR 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，冰上撥出海馬組織，液氮中研磨并加入Trizol 試劑，按照說明書步驟提取組織中的總RNA。計算RNA 濃度并用Fermentas 試劑盒反轉錄成cDNA，再進行qPCR[7]，并根據2-ΔΔCt計算出各目的基因的相對表達量。引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2. Sequences of the primers

2.5 蛋白質提取及Western blot 參照文獻[6]，大鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離海馬組織后放-80℃冰箱備用。冰箱取出后加入液氮和裂解液，于研缽中研磨裂解，經4℃離心，取上清液測定蛋白濃度（BCA 試劑盒），定量后煮沸變性，配膠上樣（30 μg總蛋白）進行SDS-PAGE，轉膜至PVDF 膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h 后，4℃冰箱過夜孵育Ⅰ抗（BDNF、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、C-C3、p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1 和β-actin），用PBST 緩沖液洗滌各條帶（每次5 min，共3 次），室溫孵育Ⅱ抗2 h，用PBST緩沖液洗滌各條帶（每次5 min/次，共3 次），加入發光劑顯影定影，條帶掃描后用ImageJ 測算目的蛋白的灰度值[8]。

2.7 高爾基染色 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后，迅速處死取腦，經PBS 緩沖液洗滌后放入等體積的A 液和B 液混合液中，6 h 后更換一次新鮮的A液B 液混合液，連續浸泡14 d 后，取出腦組織放入C液（避光），24 h 后更換新鮮C 液并在4℃冰箱避光保存3 d。冰箱取出腦組織沉入甘油（15%）和蔗糖（20%）混合液中24 h，用冰凍切片機進行常規切片（100 μm），貼在載玻片上，經過不同梯度（50%、75%、95%和100%）的乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，選擇典型CA1區神經元并拍照，用ImageJ 軟件分析由胞體發出的樹突上第一個樹突分支，即二級樹突上（長度30～60 μm）的樹突棘數量，計算10 μm 的平均樹突棘數量，即得到樹突棘密度[8]。

2.8 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 將大鼠麻醉處死，取出腦組織進行固定透明并石蠟包埋，在石蠟切片機上切片后經過二甲苯和不同濃度的乙醇進行脫蠟，進行常規HE 染色，然后再經過不同濃度的乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察[8]。

2.9 ELISA 實驗 取各組大鼠海馬部稱重勻漿離心取上清液，按照ELISA 試劑盒（碧云天）步驟檢測海馬中白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量[5]，單位為μg/（g tissue）。

3 統計學處理

應用GraghPad Prism 8 和SPSS 17 統計學軟件分析數據。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組之間采用單因素方差分析，用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Sin作用后體重、糖水偏好和行為學指標的變化

如圖1 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組大鼠體重和曠場實驗中央不動時間顯著減少，糖水偏好和曠場實驗總距離顯著下降，強迫游泳不動時間顯著增加；而Sin作用后，體重、移動總距離和中間停留時間均顯著增加，強迫游泳中的不動時間顯著降低，糖水偏好顯著增加（P＜0.05）。

Figure 1. The changes of body weight，sucrose preference and behavioral indicators in the 4 groups. A：body weight；B：sucrose preference；C：total distance；D：open-field test；E：forced swimming. Mean±SD. n=30. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖1 4組大鼠之間體重、糖水攝取及行為學指標的變化

2 Sin 作用后海馬結構完整，樹突棘密度升高，突觸相關蛋白表達上調

與Ctrl 組相比，CUMS 組海馬區細胞排列紊亂，細胞間隙增大，多數細胞變性萎縮（圖2A）；樹突棘密度下降（P＜0.05），見圖2B；突觸重塑相關蛋白BDNF 在蛋白和mRNA 水平均顯著下調（P＜0.05），見圖2C、D。Sin 作用后，海馬區細胞形態為圓形較規則，細胞核清晰（圖2A）；樹突棘密度顯著升高（P＜0.05），見圖2B；BDNF 表達在蛋白和mRNA 水平均顯著上調（P＜0.05），見圖2C、D。

3 Sin 作用后海馬Notch 信號通路相關蛋白表達上調

Western blot 結果顯示，與Ctrl 組相比，CUMS 組Notch1、Hes1和Jagged1表達顯著下調（P＜0.05）；Sin作用后，Notch1、Hes1 和Jagged1 表達顯著上調（P＜0.05），見圖3A。qPCR 結果與Western 結果一致，見圖3B。

4 Sin作用后海馬Bcl-2表達上調，C-C3表達下調

如圖4 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調（P＜0.05），凋亡蛋白caspase-3活化形式C-C3 表達顯著上調（P＜0.05）；Sin 作用后，Bcl-2表達顯著上調（P＜0.05），C-C3表達顯著下調（P＜0.05）。我們同時用qPCR 檢測Bcl-2 和caspase-3 的mRNA 水 平，結 果 與Western blot 結 果一致。

5 Sin 作用后海馬mTOR 信號通路相關蛋白表達上調

如圖5 所示，與Ctrl 組相比，CUMS 組mTOR 和下游靶基因4EBP1磷酸化水平顯著降低；Sin處理后p-mTOR和p-4EBP1均顯著上調（P＜0.05）。

6 Sin作用后海馬炎癥反應降低

ELISA 結果顯示，與Ctrl 組相比，CUMS 組大鼠海 馬 組 織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯 著 上 調（P＜0.05）；Sin 處理后，IL-1β 和TNF-α 顯著下調（P＜0.05），而IL-6無顯著變化（P＞0.05），見圖6。

討論

抑郁癥嚴重影響患者的健康和生活質量，成為一個不可忽視的社會問題。CUMS法建立抑郁模型，能夠有效模擬抑郁癥狀且癥狀穩定，被廣泛用于抑郁癥治療相關研究。根據文獻建立CUMS 模型[6，9]，建模28 d 后，CUMS 組體重、糖水偏好、曠場實驗總距離和中間停留時間均顯著降低，強迫游泳不動時間明顯增加，這與文獻結果一致，說明抑郁模型建立是成功的。Sin 灌胃處理后，上述抑郁癥狀均明顯減輕，說明Sin 具有一定的抗抑郁作用，可能是潛在的治療抑郁癥的藥物。

Figure 2. The changes of hippocampal structure，dendritic spine density and BDNF expression in Sin-treated CUMS rats. A：HE staining of hippocampal structure（scale bar=100 μm）；B：Golgi staining of secondary dendrites and dendritic spines（scale bar=20 μm）；C，D：the expression of BDNF at protein and mRNA levels. Mean±SD，n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖2 Sin作用后大鼠海馬結構、樹突棘密度和突觸重塑相關蛋白BDNF的變化

Figure 3. The changes of Notch signaling proteins Notch1，Hes1 and Jagged1 in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖3 Sin作用后Notch信號通路蛋白Notch1、Hes1和Jagged1表達的變化

Figure 4. The changes of apoptosis-related proteins Bcl-2 and cleaved caspase-3（C-C3）in Sin-treated CUMS rats. A：Western blot results；B：qPCR results. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖4 Sin作用后細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和C-C3的變化

Figure 5. The phosphorylation levels of mTOR and 4EBP1 in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖5 Sin作用后mTOR和4EBP1磷酸化水平的變化

Figure 6. The changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α in Sin-treated CUMS rats. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CUMS group.圖6 Sin作用后炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的變化

近年研究表明，抑郁癥發病與海馬突觸重塑性的改變緊密關聯。抑郁發生后，海馬突觸重塑相關基因表達下調，伴隨神經元的萎縮以及突觸結構和功能的改變，而氟西汀等抗抑藥物治療后海馬突觸可塑性得到明顯改善[10]。重度抑郁患者海馬區椎體細胞體積變小，并伴隨突觸蛋白表達下調。突觸重塑包括結構和功能重塑，海馬神經元結構完整性、樹突棘密度的改變直接影響著樹突的功能[11]。此外，神經營養因子維持神經元生存、生長和微環境，并參與大腦學習和記憶[12]，對突觸重塑起著重要的調節作用，其中最重要的營養因子是BDNF，在海馬和大腦皮層等豐富表達[13]，抑郁發生時，BDNF表達減少，甚至發生基因缺陷，無法正常表達。長時程增強（long-term potentiation，LTP）是重要的功能突觸可塑性，必須依賴BDNF 才能實現，因此BDNF 是重要的突觸可塑性相關蛋白[20]。本實驗中Sin處理后，抑郁大鼠海馬區細胞形態為圓形較規則，細胞核清晰，樹突棘密度顯著升高，BDNF 表達在蛋白和mRNA 水平均顯著上調，說明Sin 作用后海馬突觸可塑性明顯上調。

Notch 信號通路進化上十分保守，主要由受體、配體和下游靶分子等組成，Notch1、Jagged1 和Hes1分別是重要的受體、配體和下游靶分子，在腦內尤其海馬組織中高表達。有研究表明，糖氧剝奪和腦缺血后，大鼠體內Notch 信號通路被激活，體內阻斷Notch 通路，腦部多巴胺神經元減少，多巴胺分泌驟減直接引起一系列精神病癥狀，與腦缺血損傷、阿爾茲海默癥和抑郁等多種神經疾病發生有關[14]。Notch 信號通路在突觸重塑、學習、記憶的調控中具有非常重要的作用[15]。本研究中，Sin 處理后，抑郁大鼠海馬組織Notch1、Jagged1 和Hes1 表達均上調，Notch信號通路被激活，Sin可能通過激活Notch信號通路蛋白的表達改善海馬突觸可塑性。

抑郁發生時伴隨著較高的凋亡水平，5-HT 再攝取抑制劑氟西汀，通過上調突觸體多唾液酸神經細胞粘附分子的表達調節突觸可塑性，且凋亡水平顯著下調[16]；柴胡皂苷也通過降低海馬細胞凋亡水平緩解大鼠抑郁癥狀[17]。這說明細胞凋亡是重要的致病因素和治療靶點。本實驗中Sin作用后，抑郁大鼠抗凋亡蛋白Bcl-2 表達上調，C-C3 表達下調，說明凋亡水平顯著降低，Sin可能通過抑制細胞凋亡緩解大鼠抑郁癥狀。

研究表明，mTOR 通過磷化下游靶分子4EBP1調控海馬部突觸重塑相關蛋白的表達，與突觸可塑性的調節密切相關，如內穩態突觸可塑性的調控依賴mTOR 信號通路[18]，在大鼠內嗅-海馬通路中調節疼痛相關突觸可塑性[19]。抗抑郁藥物如氟西汀等通過上調p-mTOR 和p-4EBP1 調控CUMS 突觸重塑相關蛋白的表達[6]。本實驗中Sin 處理后，抑郁大鼠pmTOR 和p-4EBP1 均上調，mTOR 信號通路被激活，Sin 可能通過激活mTOR 信號通路調控海馬突觸重塑。

研究表明，炎癥因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 參與抑郁的病理發生過程[20]，抗抑郁藥作用后，抑郁癥患者血清中炎癥因子恢復正常水平。炎癥因子通過激活相關信號通路，維持正常的突觸可塑性以及神經代謝，最終影響情緒調節[21]。本實驗中Sin 處理后，抑郁大鼠炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著下調，炎癥反應明顯降低，Sin 可能通過降低炎性反應緩解抑郁癥狀，改善突觸可塑性。

綜上所述，Sin 作用后，抑郁大鼠海馬區炎癥反應降低，細胞凋亡信號通路被抑制，海馬結構破壞較小，與突觸重塑相關的Notch 和mTOR 通路被激活，突觸重塑相關蛋白BDNF 表達上調，突觸結構和突觸可塑性明顯改善，抑郁癥狀緩解。因此，Sin 調控CUMS 大鼠海馬神經突觸可塑性，可能與Notch 和mTOR通路的激活有關。