苦瓜蛋白對低剪切應力下apoE-/-小鼠內皮-間充質轉化的影響*

張 凱， 劉峰濤， 劉亞密， 陶 軍， 夏林珍， 梁伶俐， 王 佐△

（1南華大學附屬第二醫(yī)院重癥監(jiān)護室，2南華大學心血管疾病研究所，湖南衡陽421001）

內皮-間充質轉化（endothelial mesenchymal transition，EndMT）是上皮-間充質轉化的一種特殊類型，在某些生理或病理性刺激下，內皮細胞失去其特異性抗原表型（如CD31、VE-cadherin 等），轉化為間充質細胞表型[如α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、vimentin 等]，遷移和增殖能力增強，并分泌細胞外基質，且細胞黏附因子表達增加的過程。EndMT 與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生發(fā)展相關[1]，而剪切應力異常可引起EndMT 的發(fā)生[2]及AS的發(fā)生發(fā)展[3]。

苦瓜蛋白（monordicin，MD）是從苦瓜果肉分離出 來 的28 kD 蛋 白 質，其 具 有 抗 炎[4-6]和 抗AS 作用[7-9]，但作用機制仍未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子可引起EndMT 發(fā)生和發(fā)展[10-12]，低剪切應力導致炎癥因子表達水平增加[13]。因此，苦瓜蛋白具有抑制EndMT 的分子基礎。本研究擬在低剪切應力AS 動物模型中驗證苦瓜蛋白對apoE-/-小鼠AS 病變和EndMT 的抑制作用，并從抗炎的角度分析其作用機制。

材料和方法

1 實驗動物及試劑

apoE-/-雄性小鼠購自南京青紫蘭有限公司。從新鮮苦瓜果肉提取苦瓜蛋白；鼠源抗CD31單克隆抗體、鼠源抗α-SMA 單克隆抗體和兔源抗VE-cadherin多克隆抗體購自Abcam；羊抗鼠Cy3標記的紅色熒光II抗和羊抗鼠FITC 標記的綠色熒光II抗購自北京康為世紀科技公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔II抗購自Proteintech；ECL 化學發(fā)光試劑盒和蛋白定量試劑盒（BCA 試劑盒）購自北京康為世紀科技公司；Masson 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組及動物模型的構建 8 周齡雄性apoE-/-小鼠20 只，置于南華大學動物部SPF 級實驗動物房中飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（湘）2020-0002。行左側頸總動脈結扎手術后，將小鼠隨機分為模型（model）組和苦瓜蛋白組，每組10只。其中苦瓜蛋白組的小鼠腹腔注射苦瓜蛋白（5 mg·kg-1·d-1），模型組小鼠則腹腔注射等體積生理鹽水。2 組小鼠均給予高脂飼料（豬油10%、奶粉4%、膽固醇2% 、膽酸鈉0.5%及基礎飼料83.5%）喂養(yǎng)，4周后戊巴比妥麻醉處死動物。參照文獻[14]制作低剪切應力模型：5 mL/kg的1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定、脫毛、手術部位消毒，體式顯微鏡視野下手術；頸部稍偏左側皮膚作一長約4～6 mm 縱向切口，鈍性分離頸前組織，找到左側搏動的頸動脈，避開迷走神經，9-0 號的手術絲線分別結扎左側頸內、頸外動脈及枕后動脈，保持甲狀腺上動脈通暢；左側頸動脈血流減緩，形成低剪切應力（low shear stress），右側頸動脈則為生理狀態(tài)下的層流剪切應力（laminar shear stress）。手術完成后，皮膚縫合，室溫下復蘇。

2.2 免疫熒光染色和觀察 取待測玻片標本各若干張，置于室溫10 min 晾干；蒸餾水濕潤5 min；室溫下，5% BSA 封閉1 h，甩干，不洗；滴加稀釋后的第1種Ⅰ抗置于濕盒內孵育，4℃過夜；室溫下復溫后，PBS 溶液洗5 min×3 次；滴加稀釋好的第2 種Ⅰ抗?jié)窈袃确跤?℃過夜；室溫下復溫后，PBS 溶液洗5 min×3 次；室溫避光環(huán)境下，相對應的熒光Ⅱ抗Cy3孵育1 h；避光環(huán)境下，PBS溶液洗5 min×3次；室溫避光環(huán)境下，對應熒光Ⅱ抗FITC 室溫孵育1 h；避光環(huán)境下，PBS 溶液洗5 min×3 次；室溫避光環(huán)境下，使用DAPI 染核10 min；避光環(huán)境下，PBS 溶液洗5 min×3次；避光環(huán)境下，濾紙吸干殘留液體，滴加抗熒光猝滅封片劑封片；避光環(huán)境下，熒光顯微鏡下觀察并拍照保存結果。

2.3 Western blot 實驗 冰盒上分離血管組織，稱取適量組織放入1.5 mL裝有PBS的EP管中，眼科剪剪碎組織。高速低溫離心機下，4℃、3 000 r/min 離心5 min，棄除上清。將剪碎組織移入5 mL的組織研磨器中，加入一定比例的細胞裂解液（細胞裂解液∶PMSF=94∶6），于冰上研磨30 min，待其充分裂解。超速低溫離心機上，4℃、12 000 r/min離心10 min，保留上清。BCA 蛋白定量，按4∶1 體積比加入蛋白上樣緩沖液，100℃沸水中水浴8 min，上樣，SDS-PAGE分離，恒壓80 V，30 min。當溴酚藍從濃縮膠壓成一條平整的線條并進入分離膠時，將電壓調節(jié)至恒壓120 V，60 min。當溴酚藍指示劑移至分離膠底部時，終止電泳。轉PVDF 膜后，封閉、抗體雜交，化學發(fā)光法顯影、成像。

2.4 蘇木素-伊紅染色 取出冰凍切片室溫下晾干，蘇木素染色液染色5 min，0.5%鹽酸乙醇分化1～2 s，流水反藍3～5 min（注意不要直接對著組織，防止脫片），然后使用伊紅染料浸染1～2 min，乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片（載玻片與蓋破片之間呈45°夾角封片，避免產生氣泡），室溫下晾干保存。

2.5 油紅O 染色 取出冰凍切片于室溫下晾干，使用預先配制的油紅O 工作液染色20 min，60%異丙醇分化，于顯微鏡下觀察至間質清晰，流水清洗，然后使用蘇木素染液染核1 min，0.5%鹽酸酒精分化1 s，流水反藍3～5 s（調慢水流流速，避開組織），最后使用甘油明膠封片劑封片，室溫下晾干待觀察。

2.6 Masson 染色 取出冰凍切片室溫下晾干。根據(jù)說明書要求將Weigert 染液A1 和Weigert 染液A2等量混合為Weigert 鐵蘇木素染色（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。Weigert 鐵蘇木素染色液染色5 min（可省略）。酸性乙醇分化液分化1～3 s、雙蒸水漂洗1 s。藍化液浸潤3 min，雙蒸水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色5 min。按雙蒸水∶弱酸溶液=2∶1的比例配制弱酸工作液。弱酸工作液洗1 min。磷鉬酸溶液洗1 min。弱酸工作液洗1 min。置于苯胺藍染色液中染色1 min。弱酸工作液洗1 min。乙醇脫水，二甲苯透明。中性樹膠封片，室溫下晾干。鏡下觀察，膠原纖維/蛋白和細胞核染為藍色，細胞漿、肌肉及紅細胞染成紅色。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析。結果均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用t檢驗比較組間差異。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1 低剪切應力損傷血管內皮結構完整性

選取模型組apoE-/-小鼠兩側頸動脈，免疫熒光觀察血管內皮細胞的分布情況。未行結扎手術的右側頸動脈為層流剪切應力組，左側頸動脈為低剪切應力組。結果顯示，層流剪切應力組內皮細胞分布連續(xù)，熒光強度強，低剪切應力組內皮細胞分布斷續(xù)，強度較弱，說明異常剪切應力損傷血管內皮完整性，見圖1。

Figure 1. Low shear stress damaged the structural integrity of vascular endothelial cells. The scale bar=50 μm.圖1 低剪切應力損傷血管內皮細胞結構完整性

2 苦瓜蛋白抑制低切應力下頸動脈動脈粥樣硬化

體視顯微鏡下，右側未結扎頸總動脈無動脈粥樣硬化病變，而左側結扎側有明顯的動脈粥樣硬化病變，見圖2A；HE 染色顯示，模型組左側頸總動脈病變面積顯著高于苦瓜蛋白組（P＜0.05）；油紅O 染色可見模型組斑塊脂質蓄積顯著高于模型組苦瓜蛋白組（P＜0.05），Masson 染色顯示苦瓜蛋白組膠原蛋白與肌肉的比值顯著低于模型組（P＜0.05），見圖2B、C。以上結果說明苦瓜蛋白具有抑制AS作用。

3 苦瓜蛋白抑制低剪切應力誘導的內皮間轉化

模型組內皮標志物分布斷續(xù)，熒光強度較弱，間充質標志物表達量多，且紅色與綠色熒光出現(xiàn)共定位區(qū)域，呈現(xiàn)黃色熒光，說明出現(xiàn)了部分EndMT；苦瓜蛋白組內皮標志物分布較連續(xù)，有少許斷開，熒光強度較強，間充質標志物表達量低于模型組，未出現(xiàn)紅色熒光與綠色熒光共定位，說明苦瓜蛋白具有抑制EndMT作用，見圖3A。

Western blot 檢測顯示，苦瓜蛋白組左側頸動脈低剪切應力區(qū)域內皮標志物VE-cadherin 的蛋白表達量顯著高于模型組（P＜0.05），間充質標志物α-SMA 蛋白表達量則顯著低于模型組（P＜0.05），說明模型組該區(qū)域發(fā)生EndMT，且苦瓜蛋白能抑制低剪切應力導致的EndMT，見圖3B。

4 苦瓜蛋白對apoE-/-小鼠血漿炎癥因子水平的影響

ELISA 分別檢測兩組apoE-/-小鼠血漿中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-10 的分泌水平。結果發(fā)現(xiàn)苦瓜蛋白組促炎因子TNF-α、IL-6 及IL-1β 的分泌水平與模型組相比均顯著下降（P＜0.01），而抗炎因子IL-10 分泌水平與模型組相比輕微升高，差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），說明苦瓜蛋白降低血漿促炎因子TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌，見圖4。

Figure 2. The effect of momordicin on carotid atherosclerosis under low shear stress. A：comparison of atherosclerosis between the two groups under a stereo microscope（×0.75）；B：the effect of momordicin on atherosclerotic plaque（scale bar=50 μm）；C：statistical graphs. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs model group.圖2 苦瓜蛋白對低切應力下頸動脈動脈粥樣硬化的影響

5 苦瓜蛋白對apoE-/-小鼠頸動脈斑塊中ICAM-1及VCAM-1表達水平的影響

Western blot 檢測黏附因子ICAM-1 和VCAM-1表達情況。結果顯示，苦瓜蛋白組ICAM-1和VCAM-1 的表達顯著低于模型組（P＜0.01），說明苦瓜蛋白能減少低剪切應力誘導的AS 斑塊中ICAM-1 和VCAM-1的分泌表達水平，具有保護內皮結構完整性的作用，見圖5。

討論

苦瓜蛋白是從將苦瓜果肉中分離的分子量為28 kD 的水溶性蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜蛋白具有抗AS 作用，它通過上調ATP 結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）[9]和下調?；鵆oA 膽固醇?；D移酶（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase，ACAT）[7]，抑制THP-1 源性巨噬細胞細胞泡沫化的形成，還可通過增加apoE-/-小鼠小腸中ABCG5 和ABCG8 的表達，降低血脂水平，減少主動脈斑塊及主動脈竇脂質沉積[8]?？喙系鞍啄軌蛞种芅F-κB核轉位，減少炎癥因子的分泌[6]。

內皮細胞在EndMT 過程存在一系列的形態(tài)、表面分子標志物和細胞功能的變化。內皮細胞間連接消失、細胞形態(tài)由鋪路鵝卵石形態(tài)轉化為細長梭形是EndMT過程中的重要病理形態(tài)變化。我們在模型組發(fā)現(xiàn)內皮標志物出現(xiàn)斷續(xù)，很可能是內皮細胞的連接消失所引起，苦瓜蛋白明顯抑制這種斷續(xù)的出現(xiàn)，因此苦瓜蛋白對內皮具有保護作用。EndMT 還會伴隨細胞表型的轉變而出現(xiàn)的細胞分子標志物的變化，低剪切應力可促進間充質標志物（α-SMA、vimentin 等）表達增多和內皮細胞標志物（CD31、VEcadherin 等）表達減少，但這種變化受到苦瓜蛋白的抑制，表明苦瓜蛋白能從分子水平調控EndMT，產生有利于內皮表型分子標志物表達的結果，從而抑制EndMT的發(fā)生發(fā)展。Masson染色的結果也支持苦瓜蛋白對EndMT 具有抑制作用這一結論。EndMT 還會出現(xiàn)細胞功能改變，即內皮細胞合成膠原蛋白和遷移、增殖能力增強，相關轉錄因子（Snail、Slug、NFκB 等）表達上調，轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）表達升高，苦瓜蛋白是否對內皮細胞功能變化產生影響，有待于進一步的體外細胞實驗驗證。

Figure 3. The effect of momordicin on the expression of endothelial marker VE-cadherin and mesenchymal marker α-SMA in low shear stress regions. A：immunofluorescence images；B：Western blot and its statistical analysis. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs model group.圖3 苦瓜蛋白對低剪切應力區(qū)域內皮標志物VE-cadherin及間充質標志物α-SMA表達的影響

Figure 4. The effect of momordicin on plasma levels of inflammatory factors in apoE-/-mice. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs model group.圖4 苦瓜蛋白對apoE-/-小鼠血漿炎癥因子的影響

Figure 5. The effect of momordicin on the expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in carotid plaques of apoE-/-mice. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs model group.圖5 苦瓜蛋白對apoE-/-小鼠頸動脈斑塊中ICAM-1 及VCAM-1表達水平的影響

Moonen 等[15]發(fā)現(xiàn)，均勻的層流剪切應力通過激活ERK5 信號通路抑制EndMT，發(fā)揮抗AS 的功能。同時體內外實驗也證明在血管分叉和血管彎曲處的低剪切應力區(qū)域，發(fā)生致動脈粥樣硬化的EndMT。本實驗通過左側頸動脈結扎手術造成剪切應力異常，并高脂喂養(yǎng)，建立apoE-/-小鼠AS模型。左側頸動脈結扎術結扎左側頸內、頸外動脈及枕后動脈，保持甲狀腺上動脈通暢，該區(qū)域近心端血流流速減慢為低剪切應力區(qū)域，該區(qū)域自噬活性減弱[16]，是AS 病變好發(fā)區(qū)，本實驗的病理切片即選擇這個區(qū)域的血管組織，而右側頸動脈血流正常的層流剪切應力（?？捎脕碜鲗φ眨?。通過免疫熒光實驗檢測發(fā)現(xiàn)模型組發(fā)生了明顯的EndMT，苦瓜蛋白能抑制EndMT。這一發(fā)現(xiàn)，豐富了苦瓜蛋白的抗AS 作用機制，同時，苦瓜蛋白應表現(xiàn)出可用于異常血流剪切應力區(qū)域好發(fā)AS 的防治潛力，拓寬了苦瓜蛋白的抗AS 作用前景和深度。

關于EndMT 的發(fā)生機制，目前多認為與炎癥反應有關[17-21]。血管震蕩剪切應力和低剪切應力區(qū)域，這些區(qū)域可通過激活轉錄因子[如NF-κB、早期生長反應因子1（early growth response-1，Egr-1）、激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）等]來調節(jié)炎癥的反應[17]。NF-κB 是一類重要的致炎轉錄因子，促進下游靶基因基因如ICAM-1、VCAM-1 和MCP-1 等高表達誘導白細胞的聚集和炎癥反應[18-19]。低剪切力區(qū)域NF-κB 激活，并通過負反饋機制調控一氧化氮合酶和一氧化氮的表達，促進AS 的形成[20]。炎癥是誘導EndMT 的關鍵[21]。一方面，促炎通路能與TGF-β協(xié)同誘導EndMT，在炎癥的刺激下加速AS 的進程。促炎細胞因子（如IL-1β、TNF-α）激活NF-κB 轉錄，TGF-β1 和TGF-β2 表達上調，導致EndMT[22]。另一方面，促炎通路也能通過不依賴TGF-β 的途徑誘導EndMT。Mahler 等[23]發(fā)現(xiàn)，促炎細胞因子（TNF-α 和IL-6）調控胚胎及成人瓣膜內皮細胞的EndMT 過程，與TGF-β1 無關。本研究發(fā)現(xiàn)苦瓜蛋白能抑制炎性因子的產生，故苦瓜蛋白的抗炎作用可能是其抑制EndMT的重要原因。

綜上所述，本研究結果提示苦瓜蛋白通過抑制低剪切應力誘導的EndMT，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，其機制可能包括苦瓜蛋白通過下調低剪切應力誘導的黏附因子ICAM-1 和VCAM-1 的表達，減少細胞因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌，同時抑制EndMT過程，從而減輕動脈粥樣硬化。