補腦軟膠囊對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

陳二林，李喜香*，吳國泰，馬慧萍，潘從澤，李 翔

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 73000；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四O醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，現(xiàn)已成為嚴重危害老年人身心健康的常見病、多發(fā)病之一，至今西醫(yī)臨床尚缺乏特異性有效治療藥物，因此從中藥中尋找和開發(fā)具有腦神經(jīng)細胞保護作用的藥物用于防治AD具有十分重要的意義[1-3]。研究表明，β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是誘發(fā)AD的核心環(huán)節(jié)[4]。淀粉樣斑塊是一種不溶水的準晶體沉積，其主要成分為Aβ肽，由跨膜淀粉樣前體蛋白斷裂形成。Aβ沉積后具有很強的神經(jīng)毒性，導致產(chǎn)生老年斑(SPs)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)以及炎癥反應，致使神經(jīng)元變性凋亡，從而誘發(fā)AD[5-8]。

補腦膏是甘肅省中醫(yī)院的醫(yī)院制劑 (甘藥制字Z04000828)，是在古方“佛手方 (當歸、川芎)”的基礎(chǔ)上，合用黃芪、赤芍、補骨脂、枸杞、淫羊藿、龜板、水蛭、仙靈脾、益母草、仙茅、黃精、甘草制成[9]，具有益氣養(yǎng)血、填精補髓、化瘀通絡(luò)的功效，用于腦外傷性神經(jīng)損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，動脈硬化性腦損害，腦、脊髓變性性疾病，弱智兒童及腦性癱瘓等疾病的治療，臨床應用多年，療效確切[10-12]。在前期研究過程中，筆者將補腦膏劑改進成軟膠囊，主要由補腦浸膏粉250 g、大豆油250 g、微粉硅膠5 g等組成[13]。補腦軟膠囊初步藥效學研究顯示，其對癡呆模型動物的學習和記憶功能具有明顯的改善作用[14]。本研究利用Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞損傷，考察補腦軟膠囊對損傷細胞的保護作用，為補腦軟膠囊防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株，來源于ATCC，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物與試劑

補腦軟膠囊(自制)；Aβ1-42(美國AnaSpec公司，批號：1855817)；多奈哌齊片(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號：1703055)；特級胎牛血清FBS(德國PAN公司，批號ST170307)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Solarbio公司，批號：Hyclone003)；胰蛋白酶(北京賽諾浦生物技術(shù)有限公司，批號：PB180218)；青霉素、鏈霉素混合液(碧云天生物技術(shù)公司，批號：C0222)；細胞凋亡Hoechst33258染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，批號：C1017)。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(北京瑞科中儀科技有限公司)；CKX41倒置熒光顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司)； SpectraMax i3全自動熒光酶標儀(美國Molecular公司)；TG16-W微量高速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；01A-1電熱恒溫鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)；YXQ4-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合溶液的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細胞濃度為80%～90%后傳代，隔天換液1次，待細胞進入對數(shù)生長期即可用于實驗[15]。

2.2 藥物配制

稱取補腦軟膠囊內(nèi)容物0.05 g，加4 mL PBS溶解，3 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾除菌，取續(xù)濾液即得0.012 5 g/mL母液，用無血清培養(yǎng)基稀釋，分別配制成1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的藥液，備用。取Aβ1-42備用液，每支加入10 μL DMSO溶解至5 mmol/L，再加入490 μL PBS稀釋至100 μmol/L/4 ℃孵育24 h后，14 000 g×10 min離心，取上清液，4 ℃避光保存，備用。取1片鹽酸多奈哌齊稱重，稱取0.050 2 g(含1.8 mg多奈哌齊)，用1 mL DMSO溶解，3 000 r/min離心取上清液，PBS稀釋4倍，過濾除菌，取續(xù)濾液得0.45 mg/mL的母液，備用。

2.3 Aβ1-42適宜濃度選擇

將濃度為5×106個/mL的SH-SY5Y細胞接種于96孔板，待細胞生長匯合率達70%～80%后換為無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后，對照組加入無血清培養(yǎng)基，損傷組加入終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Aβ1-42溶液，每組3個復孔[15]。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度(OD)值。

2.4 補腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊劑量選擇

將濃度為5× 106個/mL的SH-SY5Y細胞接種于96孔板，待細胞生長匯合率達70%～80%后更換為無血清培養(yǎng)基[15]。培養(yǎng)4 h后，分別加入100 μL終濃度為1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的受試物藥液，每組3個復孔。同時設(shè)置終濃度分別為0.004 5 mg/mL、0.002 5 mg/mL、0.001 mg/mL的多奈哌齊試驗組，每組3個復孔。培養(yǎng)24 h后更換無血清培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶標儀于450 nm處檢測吸光度(OD)值。

2.5 實驗分組及處理

將細胞分為空白組、對照組、Aβ1-42模型組、多奈哌齊陽性組與補腦軟膠囊內(nèi)容物高、中、低劑量給藥組。空白組加等量培養(yǎng)基，不接種細胞，將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞以5× 106個/mL接種于96孔板，待細胞融合率為80%時，各組更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，陽性組更換為含多奈哌齊的無血清培養(yǎng)基，給藥組分別更換為含高、中、低劑量的補腦軟膠囊內(nèi)容物的無血清培養(yǎng)基。除對照組外，其余各組加入Aβ1-42溶液繼續(xù)孵育24 h。

2.6 對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞形態(tài)及細胞存活率的影響

按照“2.5”項下方法分組給藥，每組6個復孔，培養(yǎng)至細胞融合率達80%后，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。更換培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育1 h，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.7 對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

按照“2.5”項下方法分組給藥，培養(yǎng)至細胞融合率達80%后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛0.5 mL，于37 ℃固定細胞15 min，PBS液洗2次，加5 mg/LHoechst33258染色液染色5 min，PBS液洗2次后，用抗熒光淬滅封片液(20 mmol/L檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH=5.5)封片后采用熒光顯微鏡觀察、拍片[16]。

2.8 統(tǒng)計學處理方法

3 結(jié)果

3.1 補腦軟膠囊內(nèi)容物對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組SH-SY5Y細胞形態(tài)正常，折光性強，軸突清晰可見，貼壁狀態(tài)良好。模型組SH-SY5Y細胞折光度下降，突觸收縮，貼壁狀態(tài)不良，有許多細胞呈懸浮狀。補腦軟膠囊內(nèi)容物組SH-SY5Y細胞形態(tài)改善，細胞突觸結(jié)構(gòu)較完整，細胞貼壁狀態(tài)較好。見圖1。

圖1 各組 SH-SY5Y 細胞形態(tài)的改變

3.2 Aβ1-42適宜濃度篩選

如表1所示，隨著Aβ1-42濃度的提高，細胞存活率逐漸降低，且Aβ1-42損傷組細胞存活率與對照組均有顯著性差異(P<0.01)。說明Aβ1-42(1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)對 SH-SY5Y細胞有明顯的損傷作用，其中Aβ1-4220 μmol/L誘導損傷適中，故選擇20 μmol/L Aβ1-42作為誘導SH-SY5Y細胞損傷的最佳濃度。

表1 Aβ1-42濃度對SH-SY5Y細胞的影響

3.3 補腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊劑量篩選

如表2所示，補腦軟膠囊內(nèi)容物在1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL對SH-SY5Y細胞毒性損傷較小，在1.25～1.25×10-2mg/mL對SH-SY5Y細胞毒性損傷較大，因此選擇1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL作為受試劑量。多奈哌齊陽性組0.004 5 mg/mL對SH-SY5Y細胞毒性損傷較大，0.002 5 mg/mL、0.001 0 mg/mL對SH-SY5Y細胞毒性損傷較小，因此選擇0.002 5 mg/mL作為受試劑量。

表2 補腦軟膠囊內(nèi)容物對SH-SY5Y細胞的毒性

3.4 補腦軟膠囊內(nèi)容物對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞存活率的影響

如表3所示，Aβ1-42損傷的SH-SY5Y細胞模型組吸光度明顯低于對照組，表明細胞受到了損傷或部分細胞已經(jīng)死亡。與模型組比較，補腦軟膠囊內(nèi)容物高劑量OD值低于模型組，補腦軟膠囊內(nèi)容物中劑量OD值高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；補腦軟膠囊內(nèi)容物低劑量OD值明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比較，陽性組吸光度值高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示補腦軟膠囊內(nèi)容物及多奈哌齊對Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有一定的保護作用。

3.5 補腦軟膠囊內(nèi)容物對Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

采用Hoechst33258染色觀察SH-SY5Y細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)對照組細胞核呈現(xiàn)彌散均勻的淡藍色弱熒光，而Aβ1-42模型組SH-SY5Y細胞核出現(xiàn)固縮形態(tài)和顆粒狀熒光，給予高、中、低劑量(高：1.25×10-3mg/mL，中：1.25×10-4mg/mL，低：1.25×10-5mg/mL)補腦軟膠囊內(nèi)容物孵育后，細胞顆粒狀熒光及固縮形態(tài)明顯減少。見圖2。

4 討論

阿爾茨海默病( AD)嚴重影響人類晚年的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為當今社會關(guān)注和科學研究的重點疾病之一。長期以來，老年癡呆發(fā)病機制形成了多種假說，β-淀粉樣蛋白( Aβ)學說引起了眾多研究者的關(guān)注[17-18]。該假說認為Aβ在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。Aβ可誘發(fā)神經(jīng)元細胞凋亡，從而引起神經(jīng)細胞功能紊亂和死亡，最終導致AD的發(fā)生[16]。

圖2 Hoechst33258染色觀察細胞凋亡情況

本研究結(jié)果顯示，SH-SY5Y神經(jīng)細胞采用Aβ1-42造模損傷后，與空白組比較，細胞折光度下降，突觸收縮，貼壁狀態(tài)不良，細胞存活率下降，顯示Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞AD體外模型構(gòu)建成功。補腦軟膠囊用藥組顯示細胞突觸結(jié)構(gòu)消失減少，細胞貼壁狀態(tài)明顯改善，細胞形態(tài)學顯示補腦軟膠囊對SH-SY5Y神經(jīng)細胞具有保護作用。利用Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況，對照組細胞核呈現(xiàn)均勻的弱熒光，Aβ1-42模型組細胞核出現(xiàn)固縮形態(tài)和顆粒狀熒光，補腦軟膠囊用藥組顯示細胞核顆粒狀熒光及固縮形態(tài)明顯減少，表明補腦軟膠囊可有效抑制Aβ1-42引起的SH-SY5Y細胞凋亡，對Aβ1-42損傷的SH-SY5Y神經(jīng)細胞具有明顯的修復和保護作用。